【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于凝血功能检测领域，具体涉及一种含有稳定剂的凝血酶溶液及其应用。
技术介绍
1、在生理情况下，人体的凝血、抗凝血与纤维蛋白溶解(纤溶)系统相互作用、相互制约，并受神经-体液的调节，使血液既不溢出血管壁而出血，也不在血管内发生凝固而导致血栓形成。血液凝固(简称凝血)是由凝血因子按一定顺序相继激活而生成凝血酶，最终使纤维蛋白原变为纤维蛋白的过程。
2、纤维蛋白原(fib，fibrinogen)，即凝血因子1，是凝血系统的核心蛋白质，正常参考值：2-4g/l，纤维蛋白原测定的临床意义包括但不限于：1.病理性增高：(1)血栓前状态和血栓性疾病时，机体凝血功能增强，血浆纤维蛋白原增多，如急性心肌梗塞、糖尿病、妊娠高血压症、动脉粥样硬化、恶性肿瘤等。(2)蛋白合成增多，如结缔组织病、多发性骨髓瘤等。(3)反应性增多，如急性感染、急性肾炎、烧伤、休克、大手术后等。2.病理性降低：(1)消耗过多，导致血浆含量减少，如dic等。(3)纤溶系统活性增强，fib被分解，如原发性纤溶亢进症等。(4)合成减少，如重症肝炎、肝硬化等。
3、纤维蛋白原(fib)活性浓度检测、凝血酶时间(tt，thrombin time)检测，都是使用凝血酶添加法(clauss法)对血浆中的纤维蛋白原进行测定。fib检测试剂是通过在体外添加足量的凝血酶，记录使纤维蛋白原完全转化成纤维蛋白所形成凝固的时间，纤维蛋白原含量与凝固时间呈负相关性，检测结果与参比血浆制成的标准曲线对比可定量得出纤维蛋白原的含量。tt检测试剂中添加标准量的凝血酶，血浆
4、抗凝系统则是阻碍纤维蛋白原转化形成纤维蛋白的过程。抗凝系统主要由细胞与抗凝因子完成，抗凝因子是一系列蛋白质，主要包括丝氨酸蛋白酶抑制剂类，如抗凝血酶iii(at-iii)。at-iii系统是抗凝血酶系统是体内最主要的抗凝系统，at-iii与肝素结合后其抗凝作用大幅度增强，与凝血酶或凝血因子ixa、xa、xia、xiia、纤溶酶等丝氨酸蛋白酶以1:1的比例形成复合物，使这些酶失去活性，发挥抗凝作用。
5、目前检测at-iii的试剂盒主要采用发色底物法，其检测原理是添加过量的凝血酶与待测样本中的at-iii作用，形成无活性的复合物，发色底物与剩余的凝血酶反应生成产色基团，显色的深浅与at-iii活性成相关性。当血液中at-iii水平低于正常范围，则增加形成血栓的风险，是发生静脉血栓和肺栓塞的常见原因之一。血液中at-iii缺乏可由多种原因造成，如at-iii合成降低，主要见于肝硬化、重症肝炎、肝癌晚期等；at-iii丢失增加，见于肾病综合症；at-iii消耗增加，见于血栓前期和血栓性疾病，如弥散性血管内凝血(dic)、心绞痛、心肌梗死等；先天性at-iii缺陷或异常。
6、综上所述，无论是fib检测试剂，tt检测试剂还是at-iii检测试剂，其试剂中核心组分都是凝血酶。凝血酶作为生物大分子，其活性依赖于其自身正确的三维空间结构的维系。通常在试剂液体溶液环境中，酶的三维空间结构是非常脆弱的，酸、碱、温度变化或者一些化合物的少量存在都会引起这种空间结构的变化甚至瓦解，而即使结构发生了局部变化也可能会引起酶活性的丧失。因此，冻干试剂一直是保持生物大分子活性的最佳选择，且冻干试剂复溶前的保存期长、长期稳定性好。目前国际凝血巨头如siemens、stago、werfen等公司的含凝血酶的试剂都以冻干试剂为主。但即使是冻干品，如果有吸潮等情况发生，也会逐步丧失活性；而且冻干过程控制不当可能出现瓶间差。另外，冻干试剂不能直接使用，需要人手工复溶，而复溶过程用水或人员操作不当可能带来污染源，影响检测结果；且复溶后稳定性不佳，通常只能稳定1-2周。因此如果能开发一种液体试剂且具备较好的长期稳定性，其无需复溶直接使用，可有效避免冻干粉复溶的误差和操作不便，瓶间差异小，则市场前景广阔，能更好的满足客户对于试剂性能和易用性的需求。
7、此外，对于fib检测试剂、tt检测试剂、at-iii检测试剂，均添加凝血酶，因此，减少抗凝药物对凝血酶的干扰，确保测值的准确性也同样重要。肝素和达比加群是两类常用的口服抗凝药物。小剂量肝素与at-iii结合后，即能使at-iii的反应部位(精氨酸残基)更易与凝血酶的活性中心(丝氨酸残基)结合成稳定的凝血酶－抗凝血酶复合物，从而灭活凝血酶。口服达比加群酯，经胃肠吸收后，在体内转化为达比加群，达比加群结合于凝血酶的纤维蛋白特异结合位点，抑制凝血酶对于纤维蛋白原的激活。fib检测试剂、at-iii检测试剂结果反应的是机体内真实的纤维蛋白原含量、抗凝血酶含量，需对抗凝药物表现不敏感，如果测值表现敏感，将无法判断测值的变化是因为机体中纤维蛋白原含量或抗凝血酶含量发生了变化，还是因为使用了抗凝药物导致的。要求tt检测试剂对抗凝药物有适当的敏感性和抗干扰能力，tt检测试剂在临床上用于普通肝素治疗的监测指标，患者体内肝素增多或类肝素样抗凝物质存在时，如肾病、肝病患者，tt秒值显示出相对应幅度的延长。tt结果的秒值和血浆中达比加群的药物浓度有线性关系，但其对达比加群过于敏感，一般仅用于判断达比加群是否存在。
8、目前已有《凝血酶溶液的稳定剂》(cn106350499b)专利公开了乳酸根离子与谷氨酸根离子具有稳定凝血酶溶液的协同效应，用于提高fib、tt液体试剂的稳定性。专利《凝血酶溶液、试剂盒、凝血酶的稳定化方法、检测试剂以及凝血酶时间的测定方法》(cn112578130 a)通过在液体试剂中添加水乳剂型有机硅消泡剂，使得凝血酶能够长时间在溶剂中保持稳定。但上述专利都没有提及如何提升含凝血酶的试剂对抗凝药物的干扰能力。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是针对现有液体型凝血酶溶液在稳定性及抗干扰能力方面存在的不足，在fib/tt/at等涉及凝血酶为核心组分的检测试剂中增加新的稳定剂-凝血酶原，以得到一种稳定性更好的、对抗凝药物的抗干扰能力更强的液体型测定试剂，从而延长保存时间，降低保存成本，方便使用，减少实验误差。此外，凝血酶原在冻干的凝血酶相关试剂中使用也可提升试剂对抗凝药物的抗干扰能力。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案施行：
3、第一方面，本专利技术提供一种包含稳定剂的凝血酶溶液或其冻干试剂，所述稳定剂为凝血酶原。
4、凝血酶原是血液凝固因子之一，是凝血酶的前身物质，是由肝脏合成的维生素k依赖因子之一，存在于血浆中，血浆中含量为10-15毫克/分升，分子量为68000的糖蛋白，亦称第ii因子。在电泳上分布在α2-球蛋白部分，等电点为ph 4.2。含579个氨基酸残基的单链糖蛋白，分子量7200本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种包含稳定剂的凝血酶溶液或其冻干试剂，其特征在于，所述稳定剂为凝血酶原。
2.根据权利要求1所述的包含稳定剂的凝血酶溶液或其冻干试剂，其特征在于，所述凝血酶溶液或其冻干试剂中，凝血酶与凝血酶原的浓度比例为(30-60)：1。
3.根据权利要求2所述的包含稳定剂的凝血酶溶液或其冻干试剂，其特征在于，所述凝血酶原的含量范围，以凝血酶溶液的总体积计算，为0.1μg/mL-10μg/mL。
4.根据权利要求3所述的包含稳定剂的凝血酶溶液或其冻干试剂，其特征在于，所述包含稳定剂的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的总体积计算，还包括下述含量的组分：凝血酶1U/mL-100U/mL，缓冲剂0.5wt％～5wt％，无机钠盐：0.5wt％～2wt％，非极性氨基酸：5wt％～10wt％，多糖：1wt％～5wt％，聚乙二醇：0.01wt％～0.1wt％，防腐剂：0.1wt％～0.3wt％。
5.根据权利要求4所述的包含稳定剂的凝血酶溶液或其冻干试剂，其特征在于，所述凝血酶的来源为牛源、猪源、人源中的一种或几种的混合、通过基因工程法制备的凝血酶或市售的药品
6.根据权利要求4所述的包含稳定剂的凝血酶溶液或其冻干试剂，其特征在于，所述缓冲剂选自tris缓冲液、mops缓冲液、popos缓冲液、hepes缓冲液、pipes缓冲液、磷酸缓冲液、咪唑缓冲液中的一种或多种；所述无机钠盐包括氯化钠和硫酸钠中的一种；所述非极性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸和苯丙氨酸中的一种；所述聚乙二醇的分子量范围在800-20000；所述防腐剂选自Proclin300、山梨酸钾、叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞中的一种或多种。
7.凝血酶原用于提高凝血酶溶液或其冻干试剂稳定性的用途。
8.权利要求1-6任一项所述的凝血酶溶液或其冻干试剂用于制备试剂的用途，其特征在于所述试剂的核心组分是凝血酶；优选地，所述试剂为凝固法纤维蛋白原检测试剂、凝固法凝血酶时间检测试剂或发色底物法抗凝血酶III检测试剂。
9.一种试剂，其特征在于，所述试剂含有权利要求1-6任一项所述的的凝血酶溶液；
10.一种试剂盒，其包含权利要求9所述的试剂。
...【技术特征摘要】
1.一种包含稳定剂的凝血酶溶液或其冻干试剂，其特征在于，所述稳定剂为凝血酶原。
2.根据权利要求1所述的包含稳定剂的凝血酶溶液或其冻干试剂，其特征在于，所述凝血酶溶液或其冻干试剂中，凝血酶与凝血酶原的浓度比例为(30-60)：1。
3.根据权利要求2所述的包含稳定剂的凝血酶溶液或其冻干试剂，其特征在于，所述凝血酶原的含量范围，以凝血酶溶液的总体积计算，为0.1μg/ml-10μg/ml。
4.根据权利要求3所述的包含稳定剂的凝血酶溶液或其冻干试剂，其特征在于，所述包含稳定剂的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的总体积计算，还包括下述含量的组分：凝血酶1u/ml-100u/ml，缓冲剂0.5wt％～5wt％，无机钠盐：0.5wt％～2wt％，非极性氨基酸：5wt％～10wt％，多糖：1wt％～5wt％，聚乙二醇：0.01wt％～0.1wt％，防腐剂：0.1wt％～0.3wt％。
5.根据权利要求4所述的包含稳定剂的凝血酶溶液或其冻干试剂，其特征在于，所述凝血酶的来源为牛源、猪源、人源中的一种或几种的混合、通过基因工程法制备的凝血酶或市售的药品；...
【专利技术属性】
技术研发人员：安婧，左晓维，杨春霞，孙龙鹏，
申请(专利权)人：中元汇吉生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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