【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及催化，尤其涉及一种具有双酶活性的糖苷水解酶及其重组菌在制备稀有人参皂苷中的应用及方法。
技术介绍
1、人参皂苷(ginsenoside)，作为人参(panax ginseng c.a.mey.)这一传统中药材的核心活性成分，展现出广泛的生物活性，包括但不限于其显著的抗癌、抗炎以及抗衰老特性。深入的科学研究揭示，通过生物转化过程从原型人参皂苷衍生而来的稀有人参皂苷，因其结构上的差异，不仅增强了肠道吸收能力，还提升了生物利用度，这使得诸如人参皂苷f1、rh1、c-k等稀有人参皂苷在展现生物活性方面超越了原型分子。
2、这些稀有人参皂苷的优越药理特性，为它们在医药和功能性食品产业的广泛应用奠定了坚实的基础。然而，制备稀有人参皂苷的技术挑战构成了一个明显的瓶颈，限制了它们的规模化生产和应用。鉴于此，近年来，科研人员致力于开发并优化了一系列制备策略，旨在提升稀有人参皂苷的产量和纯度，从而促进其在临床和保健领域的普及。
3、稀有人参皂苷的工业化生产主要依托于对原型人参皂苷特定糖基位点的精准水解策略。相较于传统化学合成法存在的产率低下、副产品繁多以及废液处理复杂等局限性，采用酶催化水解途径展现出显著优势，体现在其反应条件温和、环境友好且效率卓越，因而成为工业化制备稀有人参皂苷的优选方案。在这一过程中，糖苷水解酶(glycosidehydrolases,ghs)扮演着核心角色，凭借其高度专一性，能够有效催化人参皂苷苷元上的糖基断裂，进而生成目标稀有人参皂苷。
4、然而，实际工业原料通常包含多样化
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种具有双酶活性的糖苷水解酶及其在制备稀有人参皂苷和重组菌中的应用及方法，使用糖苷水解酶或使用重组细胞全细胞催化人参皂苷r1可获得rh1，催化人参皂苷rb1可获得人参皂苷c-k。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种具有双酶活性的糖苷水解酶，所述糖苷水解酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、作为优选，所述糖苷水解酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、本专利技术还提供了所述的糖苷水解酶在制备稀有人参皂苷中的应用。
6、本专利技术还提供了一种利用所述糖苷水解酶制备稀有人参皂苷的方法，包括如下步骤：在人参皂苷溶液中加入所述糖苷水解酶，催化后加入甲醇终止反应，得到稀有人参皂苷；
7、所述人参皂苷溶液的溶剂为tris缓冲液，所述人参皂苷溶液中人参皂苷的浓度为0.2～2mg/ml，所述糖苷水解酶的终浓度为0.1～1mg/ml，所述催化的条件为30～50℃、ph5.5～8，所述催化的时间为12～36h，所述甲醇和人参皂苷溶液的体积比为1：0.8～1.2；
8、所用的人参皂苷溶液中的人参皂苷为人参皂苷r1时，得到的稀有人参皂苷为人参皂苷rh1；所用的人参皂苷溶液中的人参皂苷为人参皂苷rb1时，得到的稀有人参皂苷为人参皂苷c-k。
9、本专利技术还提供了一种含有所述的糖苷水解酶基因的重组菌的构建方法，包括如下步骤：
10、(1)将seq id no.2所示的核苷酸序列进行pcr扩增后，采用同源重组的方法将其导入质粒中，得到重组质粒；
11、(2)通过化学转化法将重组质粒导入大肠杆菌bl21(de3)中，获得重组菌；
12、所述质粒的种类为petduet1或pet28a。
13、本专利技术还提供了所述的方法制备得到的重组菌。
14、本专利技术还提供了所述重组菌在制备稀有人参皂苷中的应用。
15、本专利技术还提供了一种利用所述重组菌制备稀有人参皂苷的方法，包括如下步骤：在人参皂苷溶液中加入所述重组菌，催化后加入甲醇终止反应，得到稀有人参皂苷；
16、所述人参皂苷溶液的溶剂为tris缓冲液，所述人参皂苷溶液中人参皂苷的浓度为0.2～2mg/ml，所述重组菌的终浓度为od600＝1～4，所述催化的条件为30～50℃、ph 5.5～8，所述催化的时间为12～36h，所述甲醇和人参皂苷溶液的体积比为1：0.8～1.2；
17、所用的人参皂苷溶液中的人参皂苷为人参皂苷r1时，得到的稀有人参皂苷为人参皂苷rh1；所用的人参皂苷溶液中的人参皂苷为人参皂苷rb1时，得到的稀有人参皂苷为人参皂苷c-k。
18、本专利技术还提供了所述的重组菌在制备所述糖苷水解酶中的应用。
19、本专利技术还提供了一种利用所述的重组菌制备糖苷水解酶的方法，包括如下步骤：将重组菌接种至lb培养基中，30～40℃培养，菌液浓度达到od600＝0.4～0.8时加入iptg，在15～25℃下诱导，离心后使用缓冲液重悬获得全细胞菌液，高压匀浆破碎得到粗酶液，通过ni-nta柱纯化获得纯酶；
20、所述菌液中iptg的最终浓度为0.1～0.4mm，所述诱导的条件为180～220rpm、14～18℃，诱导的时间为18～22h，所述离心的条件为5500～6500rpm，所述缓冲液为pbs缓冲液，所述全细胞菌液中菌的浓度为od600＝1.9～2.1，所述高压匀浆破碎的压力为750～850mpa，时间为4～6min。
21、本专利技术提供了一种具有双酶活性的糖苷水解酶及其在制备稀有人参皂苷和重组菌中的应用及方法，所述糖苷水解酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。使用本专利技术中的糖苷水解酶或者表达该酶的重组菌可催化人参皂苷r1生产稀有人参皂苷rh1，以及催化人参皂苷rb1生产稀有人参皂苷c-k。本专利技术所述糖苷水解酶同时具有木糖苷酶和葡萄糖苷酶活性，因此使用该酶或重组细胞可以同时断裂人参皂苷r1苷元上c-6位的木糖苷键和葡萄糖苷键生成稀有人参皂苷rh1，对比单一酶活性的糖苷水解酶制备稀有人参皂苷的方法，具有工艺简单经济节约的优点，非常适合于大规模工业化生产。
22、本专利技术的有益效果包括以下几点：
23、(1)本专利技术中的糖苷水解酶b6具有水解木糖基和葡萄糖基两种活性，可以催化水解人参皂苷r1至rh1，24h产量可达0.3122mg/ml，产率为67.4％。
24、(2)本专利技术中的糖苷水解酶b6具有水解木糖基和葡萄糖基两种活性，可以通过全细胞催化的方式水解人参皂苷r1至rh1，24h产量可达0.2191mg/ml，产率为49.3％。
25、(3)本专利技术中的糖苷水解酶b6可以催化水解人参皂苷rb1至本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有双酶活性的糖苷水解酶，其特征在于，所述糖苷水解酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的糖苷水解酶，其特征在于，所述糖苷水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1或2所述的糖苷水解酶在制备稀有人参皂苷中的应用。
4.一种利用权利要求1或2所述糖苷水解酶制备稀有人参皂苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：在人参皂苷溶液中加入权利要求1或2所述糖苷水解酶，催化后加入甲醇终止反应，得到稀有人参皂苷；
5.一种含有权利要求1或2所述的糖苷水解酶基因的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.权利要求5所述的方法制备得到的重组菌。
7.权利要求6所述重组菌在制备稀有人参皂苷中的应用。
8.一种利用权利要求6所述重组菌制备稀有人参皂苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：在人参皂苷溶液中加入权利要求6所述重组菌，催化后加入甲醇终止反应，得到稀有人参皂苷；
9.权利要求6所述的重组菌在制备权利要求1或2所述糖苷水解酶中的应用。
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