【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种热稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用。
技术介绍
1、l-瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，也是人体氨基酸代谢尿素循环的中间产物，具有很多重要的生理功能，如清除自由基、作为异体排斥效应指示剂、帮助血管舒张、稳定血压、治疗风湿关节炎、高血压、冠心病和男性性功能障碍等，在营养学和医学领域应用前景广阔。
2、l-瓜氨酸的主要制备方法有提取法、化学合成法、发酵法和酶法，其中酶法是利用微生物细胞中精氨酸脱亚胺酶催化l-精氨酸转化合成l-瓜氨酸，具有生产周期短、专一性强、产物纯化容易等优点，是目前生产瓜氨酸最重要的方法。但是现有的精氨酸脱亚胺基酶在37℃下稳定性差，且随着温度上升，稳定性越来越差，影响了l-瓜氨酸的转化效率。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于通过对精氨酸脱亚胺酶进行定点突变，获得热稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，可用于37℃下高效催化l-精氨酸生成l-瓜氨酸，提高生产效率。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供了下述技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种精氨酸脱亚胺酶突变体，所述精氨酸脱亚胺酶突变体在seq id no:1所示精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列基础上含有多个位点的下述氨基酸突变：p187w、t102w、g323w、g398w、a161f、t289y、t164w、s140w、c404r和d355w。
4、在本专利技术的一种实施方式中，所述精氨酸脱亚胺酶突变体在seq id no:
5、在本专利技术的一种实施方式中，所述精氨酸脱亚胺酶突变体在seq id no:1所示精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列基础上含有p187w、d355w两个位点的氨基酸突变，以及g323w、g398w、t102w中的任一位点的氨基酸突变。
6、在本专利技术的一种实施方式中，所述精氨酸脱亚胺酶突变体在seq id no:1所示的精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列基础上具体下述三个氨基酸位点突变：p187w、g323w、d355w；所述精氨酸脱亚胺酶突变体的氨基酸序列为seq id no:3。
7、在本专利技术的一种实施方式中，所述精氨酸脱亚胺酶突变体在seq id no:1所示的精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列基础上具体下述三个氨基酸位点突变：p187w、d355w、g398w；所述精氨酸脱亚胺酶突变体的氨基酸序列为seq id no:5。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述精氨酸脱亚胺酶突变体在seq id no:1所示的精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列基础上含有下述三个氨基酸位点突变：t102w、p187w、d355w；所述精氨酸脱亚胺酶突变体的氨基酸序列为seq id no:7。
9、上述精氨酸脱亚胺酶突变体的热稳定性高于野生型精氨酸脱亚胺酶。
10、在本专利技术的一种实施方式中，相较于野生型精氨酸脱亚胺酶，所述精氨酸脱亚胺酶突变体的半衰期延长了至少3h。
11、第二方面，本专利技术提供了一种编码上述精氨酸脱亚胺酶突变体的核酸分子。
12、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:4所示。
13、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:6所示。
14、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:8所示。
15、第三方面，本专利技术提供了一种含有编码上述精氨酸脱亚胺酶突变体的核酸分子的表达盒。
16、进一步地，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述精氨酸脱亚胺酶突变体的核酸分子，该核酸分子不但可包括启动上述突变体编码基因序列转录的启动子，还可包括终止上述突变体编码基因序列转录的终止子。更进一步地，所述表达盒还可包括增强子序列。
17、第四方面，本专利技术提供了一种含有编码上述精氨酸脱亚胺酶突变体的核酸分子的重组载体。
18、进一步地，所述载体可为质粒载体、黏粒载体、噬菌体载体、或病毒载体。
19、第五方面，本专利技术提供了一种表达上述精氨酸脱亚胺酶突变体的重组微生物。
20、进一步地，所述重组微生物含有编码上述精氨酸脱亚胺酶突变体的核酸分子、表达盒、或重组载体。
21、进一步地，所述重组微生物为表达上述精氨酸脱亚胺酶突变体的原核微生物或真核微生物。
22、在本专利技术的一种实施方式中，所述原核微生物为大肠杆菌。
23、第六方面，本专利技术提供了上述精氨酸脱亚胺酶突变体、编码所述精氨酸脱亚胺酶突变体的核酸分子、含有所述核酸分子的表达盒、含有所述核酸分子的重组载体、或表达上述精氨酸脱亚胺酶突变体的重组基因工程菌在制备精氨酸脱亚胺酶中的应用。
24、在本专利技术的一种实施方式中，将编码精氨酸脱亚胺酶突变体的核酸分子在微生物中进行表达，制得热稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶。
25、在本专利技术的一种实施方式中，将上述重组微生物经发酵培养、诱导表达胞内精氨酸脱亚胺酶后离心，收集菌体；将菌体破碎，获得含热稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶的破碎菌液。
26、进一步地，将上述含酶破碎菌液离心，得到含热稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶的粗酶液(上清液)；
27、进一步地，使用ni柱纯化上述粗酶液，得到纯度较高的纯酶液。
28、第七方面，本专利技术提供了上述精氨酸脱亚胺酶突变体、编码所述精氨酸脱亚胺酶突变体的核酸分子、含有所述核酸分子的表达盒、含有所述核酸分子的重组载体、或表达上述精氨酸脱亚胺酶突变体的重组微生物在生产l-瓜氨酸中的应用。
29、第八方面，本专利技术提供了一种l-瓜氨酸的生产方法，所述生产方法为下述(a)或(b)：
30、(a)利用精氨酸脱亚胺酶催化l-精氨酸生成l-瓜氨酸，所述精氨酸脱亚胺酶包含上述精氨酸脱亚胺酶突变体；
31、(b)将权利要求6-7任一项所述重组微生物经发酵培养、诱导表达后，离心，获得湿菌体；以所述湿菌体或其细胞破碎液为催化剂，催化l-精氨酸生成l-瓜氨酸。
32、上述“细胞破碎液”通过下述方法获得：将上述含精氨酸脱亚胺酶突变体的重组微生物经发酵培养、诱导表达胞内精氨酸脱亚胺酶后离心，收集湿菌体；将湿菌体破碎，即得。
33、上述“包含上述精氨酸脱亚胺酶突变体”表示酶法生产l-瓜氨酸过程中使用的精氨酸脱亚胺酶可以全部是上述精氨酸脱亚胺酶突变体，也可以部分是上述精氨酸脱亚胺酶突变体。
34、在本专利技术的一种实施方式中，所述精氨酸脱亚胺酶突变体为含精氨酸脱亚胺酶突变体的粗酶液或纯酶液。
35、所述含精氨酸脱亚胺酶突变体的粗酶液通过将上述含精氨酸脱亚胺酶突变体的破碎菌液离心，收集上清液，即得。
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【技术保护点】
1.一种精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，所述精氨酸脱亚胺酶突变体在SEQ IDNO:1所示精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列基础上含有多个位点的下述氨基酸突变：P187W、T102W、G323W、G398W、A161F、T289Y、T164W、S140W、C404R和D355W。
2.根据权利要求1所述的精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，所述精氨酸脱亚胺酶突变体在SEQ ID NO:1所示精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列基础上含有至少三个位点的下述氨基酸突变：P187W、T102W、G323W、G398W、A161F、T289Y、T164W、S140W、C404R和D355W；
3.一种编码权利要求1-2任一项所述精氨酸脱亚胺酶突变体的核酸分子。
4.一种含有权利要求3所述核酸分子的表达盒。
5.一种含有权利要求3所述核酸分子的重组载体。
6.一种表达权利要求1-2任一项所述精氨酸脱亚胺酶突变体的重组微生物。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，含有权利要求3所述核酸分子、权利要求4所述表达盒、或权利要求5所述重
8.权利要求1-2任一项所述精氨酸脱亚胺酶突变体、权利要求3所述核酸分子、权利要求4所述表达盒、权利要求5所述重组载体、或权利要求6-7任一项所述重组微生物在制备精氨酸脱亚胺酶中的应用。
9.权利要求1-2任一项所述精氨酸脱亚胺酶突变体、权利要求3所述核酸分子、权利要求4所述表达盒、权利要求5所述重组载体、或权利要求6-7任一项所述重组微生物在生产L-瓜氨酸中的应用。
10.一种L-瓜氨酸的生产方法，其特征在于，所述生产方法为下述(a)或(b)：
...【技术特征摘要】
1.一种精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，所述精氨酸脱亚胺酶突变体在seq idno:1所示精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列基础上含有多个位点的下述氨基酸突变：p187w、t102w、g323w、g398w、a161f、t289y、t164w、s140w、c404r和d355w。
2.根据权利要求1所述的精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，所述精氨酸脱亚胺酶突变体在seq id no:1所示精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列基础上含有至少三个位点的下述氨基酸突变：p187w、t102w、g323w、g398w、a161f、t289y、t164w、s140w、c404r和d355w；
3.一种编码权利要求1-2任一项所述精氨酸脱亚胺酶突变体的核酸分子。
4.一种含有权利要求3所述核酸分子的表达盒。
5.一种含有...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱李敏，陈璐，张彧，刘小溪，
申请(专利权)人：安徽华恒生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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