【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于单克隆抗体制备，具体是一种通用型全猪源单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
1、单克隆抗体(monoclonal antibodies,mabs,以下简称“单抗”)是由特定的抗原刺激机体后，由单个特异性b细胞产生并分泌的仅针对该特定抗原决定簇的的抗体。相较于多克隆抗体而言，单抗在特异性和同质性方面具有明显的优势，可作为肿瘤、自身免疫性疾病、移植、病毒感染等的临床治疗和检测诊断工具，一些具有中和活性的单抗对于感染性疾病的控制和治疗有重要作用。除此之外，单抗还可以用于特定抗原的结构和功能研究。
2、单个b细胞抗体制备技术，利用记忆性b细胞表面相应受体的特点，通过流式细胞分选技术从外周血或脾脏中分选出抗原特异性单个b淋巴细胞。随后通过pcr扩增获得单个b细胞内的抗体轻链和重链编码基因，再将同一个细胞内抗体轻链和重链编码基因分别克隆至真核表达载体中，共转染至哺乳动物细胞表达获得该单个b细胞表达的单抗。该方法作为新一代快速制备抗体的方法，保持了抗体的天然组合和构象，具有快速、高效、产量高等优点。目前该方法已广泛用于艾滋、破伤风、乙型肝炎、流感等多种疾病病原抗体库的建立，并在新冠病毒单抗制备中发挥了重要作用。
3、目前基于单个b细胞技术制备单抗的方法中，大多数采取pcr扩增b细胞内抗体轻/重链可变区基因序列，再与固定的轻/重链恒定区基因序列连接，从而得到完整的可表达的抗体基因序列。由于该策略无法保证抗体可变区与恒定区之间的天然结构，可能会影响抗体的表达水平和天然活性，并且固定的恒定区基因破坏了抗体的多样性，
技术实现思路
1、本专利技术目的是为了克服现有技术的不足，提供了一种通用型全猪源单克隆抗体制备方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案予以实现：
3、本专利技术的第一方面是提供了一种用于特异性扩增猪源单个b细胞内抗体轻重链完整编码基因的通用引物组，所述通用引物组包括以下三组：
4、第一组：用于猪源单个b细胞中igg抗体重链完整基因扩增的引物，所述引物如seqid no:1-4所示，其中seq id no:1-2所示引物用于第一轮扩增，seq id no:3-4所示引物用于第二轮扩增；
5、第二组：用于猪源单个b细胞中igg抗体轻链λ链完整基因扩增的引物，所述引物如seq id no:5-8所示，其中seq id no:5-6所示引物用于第一轮扩增，seq id no:7-8所示引物用于第二轮扩增；
6、第三组：用于猪源单个b细胞中igg抗体轻链κ链完整基因扩增的引物，所述引物如seq id no:9-12所示，其中seq id no:9-10所示引物用于第一轮扩增，seq id no:11-12所示引物用于第二轮扩增。
7、进一步地，所述第一轮扩增的产物包括抗体可变区和恒定区，第二轮扩增的产物包括表达载体同源序列、抗体可变区和恒定区。
8、本专利技术提供的上述三组通用引物组可以实现在猪源单个b细胞中进行天然抗体轻链和重链基因全长的扩增，各只需一对引物，扩增效率高。因此，其可以被用于制备全猪源单抗，显示了其在制备全猪源单抗上的良好应用。
9、进一步地，制备全猪源单抗是基于单个b细胞抗体制备为基础。
10、本专利技术的另一方面是提供一种通用型全猪源单个b细胞完整抗体的制备方法，包括以下步骤：
11、s1:猪b淋巴细胞的分离和筛选；
12、s2:扩增猪单个b细胞cdna；
13、s3:采用所述通用引物组扩增猪单个b细胞内的抗体完整编码基因；
14、s4:全猪源单个b细胞抗体重组表达载体的构建：将步骤s3中扩增得到的抗体重链或轻链完整编码基因片段利用同源重组法连接到真核表达载体上，得到包含抗体完整重链或轻链编码基因的重组表达载体；
15、s5:全猪源单个b细胞抗体重链及轻链配对表达：将步骤s4获得的单个b细胞抗体完整重链和轻链共转染至哺乳动物表达细胞中，转染后收集上清，即得到该单个b细胞所表达的完整猪源单抗。
16、优选地，所述步骤s1包括利用密度梯度离心法从经过免疫或临床康复的猪外周血中分离得到外周血单核细胞，根据b细胞表面受体特点，通过流式细胞分选技术将抗原特异性的单个b淋巴细胞分选至pcr 8连管的孔中；所述步骤s2扩增猪单个b细胞cdna是以步骤s1中分离得到的猪单个b细胞为模板，按照单细胞cdna扩增试剂盒的常规操作，将单个b细胞内的mrna逆转录为cdna。
17、优选地，，所述步骤s3具体包括以下步骤：
18、s31:抗体重链完整编码基因的扩增
19、以步骤s2中扩增得到的单细胞内cdna为模版，利用所述seq id no:1-2所示引物进行第一轮扩增，以第一轮扩增的产物为模板，利用权利要求1中所述seq id no:3-4所示引物进行第二轮扩增；
20、s32:抗体轻链λ链完整编码基因的扩增
21、以步骤s2中扩增得到的单细胞内cdna为模版，利用所述seq id no:5-6所示引物进行第一轮扩增，以第一轮扩增的产物为模板，利用权利要求1中所述seq id no:7-8所示引物进行第二轮扩增；
22、s33:抗体轻链κ链完整编码基因的扩增
23、以步骤s2中扩增得到的单细胞内cdna为模版，利用所述seq id no:9-10所示引物进行第一轮扩增，以第一轮扩增的产物为模板，利用权利要求1中所述seq id no:11-12所示引物进行第二轮扩增。
24、优选地，所述步骤s4的真核表达载体为pcdna3.1-leader，所述真核表达载体中包含猪源抗体前导序列。
25、优选地，抗体重链完整编码基因第一轮及第二轮扩增的pcr程序为:98℃30s；98℃10s、60℃10s、72℃50s、35个循环；72℃5min；抗体轻链λ链完整编码基因第一轮及第二轮扩增的pcr程序为:98℃30s；98℃10s、60℃10s、72℃30s、35个循环；72℃5min；抗体轻链κ链完整编码基因第一轮及第二轮扩增的pcr程序为:98℃30s；98℃10s、60℃10s、72℃20s、35个循环；72℃5min。
26、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
27、本专利技术根据imgt和ncbi上公布的猪源igg抗体重链及轻链完整基因序本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于特异性扩增猪源单个B细胞内抗体轻重链完整编码基因的通用引物组，其特征在于，所述通用引物组包括以下三组：
2.根据权利要求1所述的用于特异性扩增猪源单个B细胞内抗体轻重链完整编码基因的通用引物组，其特征在于，所述第一轮扩增的产物包括抗体可变区和恒定区，第二轮扩增的产物包括表达载体同源序列、抗体可变区和恒定区。
3.一种权利要求1所述的通用引物组在制备全猪源单克隆抗体中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，制备全猪源单克隆抗体是基于单个B细胞抗体制备为基础。
5.一种通用型全猪源单个B细胞完整抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述通用型全猪源单个B细胞完整抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括利用密度梯度离心法从经过免疫或临床康复的猪外周血中分离得到外周血单核细胞，根据B细胞表面受体特点，通过流式细胞分选技术将抗原特异性的单个B淋巴细胞分选至PCR 8连管的孔中；所述步骤S2扩增猪单个B细胞cDNA是以步骤S1中分离得到的猪单个B细胞为模板，按照单细胞cDNA扩增试
7.根据权利要求6所述通用型全猪源单个B细胞完整抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括以下步骤：
8.根据权利要求6所述通用型全猪源单个B细胞完整抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S4的真核表达载体为pCDNA3.1-Leader，所述真核表达载体中包含猪源抗体前导序列。
9.根据权利要求6所述通用型全猪源单个B细胞完整抗体的制备方法，其特征在于，抗体重链完整编码基因第一轮及第二轮扩增的PCR程序为:98℃30s；98℃10s、60℃10s、72℃50s、35个循环；72℃5min；抗体轻链λ链完整编码基因第一轮及第二轮扩增的PCR程序为:98℃30s；98℃10s、60℃10s、72℃30s、35个循环；72℃5min；抗体轻链κ链完整编码基因第一轮及第二轮扩增的PCR程序为:98℃30s；98℃10s、60℃10s、72℃20s、35个循环；72℃5min。
...【技术特征摘要】
1.一种用于特异性扩增猪源单个b细胞内抗体轻重链完整编码基因的通用引物组，其特征在于，所述通用引物组包括以下三组：
2.根据权利要求1所述的用于特异性扩增猪源单个b细胞内抗体轻重链完整编码基因的通用引物组，其特征在于，所述第一轮扩增的产物包括抗体可变区和恒定区，第二轮扩增的产物包括表达载体同源序列、抗体可变区和恒定区。
3.一种权利要求1所述的通用引物组在制备全猪源单克隆抗体中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，制备全猪源单克隆抗体是基于单个b细胞抗体制备为基础。
5.一种通用型全猪源单个b细胞完整抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述通用型全猪源单个b细胞完整抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤s1包括利用密度梯度离心法从经过免疫或临床康复的猪外周血中分离得到外周血单核细胞，根据b细胞表面受体特点，通过流式细胞分选技术将抗原特异性的单个b淋巴细胞分选至pcr 8连管的孔中；所述步骤s2扩增猪单个b细胞cdna是以步骤s1...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱元源，黄禹丰，车斯琪，邹兴启，徐璐，李芳韬，赵俊杰，刘业兵，赵启祖，夏应菊，吴睿智，李琰，徐嫄，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：
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