【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，更具体的说是涉及甘薯羽状斑驳病毒互作寄主蛋白ibcyp1及其编码基因与应用。
技术介绍
1、甘薯(ipomoea batatas)是世界上重要的粮食、饲料和工业原料作物，总产量居世界粮食作物总产量的第7位，中国是最大的甘薯生产国，占世界总种植面积的一半以上，总产量占世界总产量的近80％。甘薯病毒病一直是甘薯上的重大病害，分布在各甘薯产区，且常发生复合侵染，病毒为害能使甘薯品种严重退化，表现出结薯量少、薯块变小和牛蒡根增多，严重降低了甘薯产量与品质。已报道能够侵染甘薯的dna和rna病毒一共约有30余种，其中dna病毒占到了16种，rna病毒占到了至少7种，可造成26～63％的甘薯产量损失。
2、甘薯是无性繁殖作物，这导致了体内病毒的累积和病毒病的蔓延，进而引起品种的种性退化、产量降低和品质下降。传统抗病育种一般采用集团杂交的方法，需筛选具有天然抗病性的优良育种材料，再深入研究其抗病毒特性。但目前发现的天然的抗病毒基因资源非常有限。安康等应用指示植物巴西牵牛嫁接法对162份甘薯种质资源的病毒抗性进行鉴定，未发现病毒免疫的甘薯品种。曹清河等利用ncm-elisa对20份甘薯近缘野生种进行了抗病毒病筛选，得到5份高抗和8份抗病毒病材料。甘薯长期无性繁殖会导致基因型高度杂合，存在严重的近交衰退现象，常规杂交育种往往十分困难且耗时较长(6-8年)。近5年来的研究显示，我国目前的主栽品种：商薯19、普薯32、烟薯25、济薯26和龙薯9号等在推广种植过程中都受到多种dna和rna病毒不同程度的为害。病毒复合
3、已有研究表明突变病毒识别的寄主植物专一性蛋白能够实现高效抗病毒效果，因此挖掘与病毒关键致病蛋白互作的甘薯基因成为甘薯抗病毒分子育种的前提和关键。spfmv的病毒基因组连接蛋白(viral protein genome-linked，vpg)可以通过与rna聚合酶互作而作为病毒rna复制酶的引物参与病毒复制，也可参与病毒的细胞间运动和长距离系统侵染，在病毒侵染循环中发挥着重要作用。
4、因此，为甘薯抗病毒分子育种提供新的靶标和途径是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了甘薯羽状斑驳病毒互作寄主蛋白ibcyp1及其编码基因与应用，本专利技术选取spfmv的vpg蛋白为诱饵，利用病毒诱导的甘薯ad-cdna酵母双杂文库，筛选与vpg互作的甘薯基因，并对甘薯互作基因的特征和功能进行了深入研究，研究结果将为甘薯抗病毒分子育种提供新的靶标和途径。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、甘薯羽状斑驳病毒互作寄主蛋白ibcyp1的编码基因，核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、本专利技术还提供了上述基因翻译得到的蛋白。
5、本专利技术还提供了包含上述编码基因的重组载体或基因表达盒。
6、本专利技术还提供了上述的重组载体的构建方法，包括以下步骤：
7、(1)针对ibcyp1 cds区中游序列设计基因沉默引物，pcr扩增获得基因片段；
8、(2)将步骤(1)基因片段与载体分别进行双酶切，连接酶连接酶切纯化后的载体和基因片段，得到vigs重组载体；
9、或，
10、(1)针对ibcyp1 cds区序列设计基因过量表达引物，pcr扩增获得基因片段；
11、(2)将步骤(1)基因片段与载体分别进行双酶切，连接酶连接酶切纯化后的载体和基因片段，得到oe重组载体。
12、优选的：步骤(1)基因沉默引物：ibcyp1-trv2-f：5’-cggaattcgtacatcgacgagaagaaca-3’，如seq id no.4所示；ibcyp1-trv2-r：5’-cgggatccatcgttttgcctgtaggaat-3’，如seq id no.5所示；
13、步骤(1)基因过量表达引物：ibcyp1-oe-f：gggtacccggggatccatggctagacttttgattctcttc，如seq id no.6所示；ibcyp1-oe-r：atgcctgcaggtcgacctagttcagaataagatcattgcc，如seq id no.7所示。
14、优选的：步骤(2)vigs重组载体：ptrv2载体；双酶切：bamhi和ecor i双酶切；连接酶：t4连接酶；
15、oe重组载体：pcambia2300-35s-ocs；双酶切：bamhi和sali双酶切；连接酶：t4连接酶。
16、本专利技术还提供了包含上述编码基因，或上述重组载体或基因表达盒的重组菌。
17、本专利技术还提供了上述编码基因，或上述重组载体或基因表达盒，或上述重组菌在育种中的应用。
18、优选的：利用vigs重组载体进行ibcyp1基因沉默，得到抗spfmv植株。
19、优选的：ibcyp1基因被沉默后表达量降低，甘薯植株的spfmv病毒含量也降低；ibcyp1基因被过量表达后表达量升高，甘薯植株的spfmv病毒含量也升高，即该基因负调控甘薯对spfmv的抗性。
20、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了甘薯羽状斑驳病毒互作寄主蛋白ibcyp1及其编码基因与应用，取得的技术效果为：
21、本专利技术从甘薯的cdna中克隆得到甘薯的low-temperature-induced cysteine基因，将其命名为ibcyp1，并通过酵母双杂交和双分子荧光互补试验证明ibcyp1与spfmv的病毒基因组连接蛋白vpg互作。基因表达量分析表明，ibcyp1的基因表达受spfmv侵染的诱导，病毒侵染后，ibcyp1基因的表达量显著增加。构建了用于沉默甘薯中ibcyp1基因的trv介导的vigs载体，转化甘薯后得到ibcyp1基因被沉默的甘薯植株，接种spfmv后，ibcyp1基因被沉默的甘薯植株的病毒含量显著低于对照组；构建了过量表达甘薯中ibcyp1基因的oe载体，转化甘薯后得到ibcyp1基因被过量表达的甘薯植株，接种spfmv后，ibcyp1基因被过量表达的甘薯植株的病毒含量显著高于对照组。
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1.甘薯羽状斑驳病毒互作寄主蛋白IbCYP1的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.由权利要求1所述基因翻译得到的蛋白。
3.包含权利要求1所述编码基因的重组载体或基因表达盒。
4.权利要求3所述的重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述基因沉默引物：IbCYP1-TRV2-F：5’-CGGAATTCGTACATCGACGAGAAGAACA-3’，如SEQ ID No.4所示；
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述VIGS重组载体：pTRV2载体；所述双酶切：BamHI和EcoR I双酶切；所述连接酶：T4连接酶；
7.包含权利要求1所述编码基因，或权利要求3所述重组载体或基因表达盒的重组菌。
8.权利要求1所述编码基因，或权利要求3所述重组载体或基因表达盒，或权利要求7所述重组菌在育种中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，利用VIGS重组载体进行IbCYP
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，IbCYP1基因被沉默后表达量降低，甘薯植株的SPFMV病毒含量也降低；IbCYP1基因被过量表达后表达量升高，甘薯植株的SPFMV病毒含量也升高，即该基因负调控甘薯对SPFMV的抗性。
...【技术特征摘要】
1.甘薯羽状斑驳病毒互作寄主蛋白ibcyp1的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如seqid no.1所示。
2.由权利要求1所述基因翻译得到的蛋白。
3.包含权利要求1所述编码基因的重组载体或基因表达盒。
4.权利要求3所述的重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述基因沉默引物：ibcyp1-trv2-f：5’-cggaattcgtacatcgacgagaagaaca-3’，如seq id no.4所示；
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述vigs重组载体：ptrv2载体；所述双酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘起丽，王海荣，李成伟，曾孙孟，姜良良，张福丽，杜建峰，郎剑锋，雷闪闪，王宏超，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：
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