一种高效获得春兰转基因苗的方法技术

技术编号：43024704 阅读：7 留言：0更新日期：2024-10-18 17:25

一种高效获得春兰转基因苗的方法，以春兰类原球茎作为外植体，置于预培养基中进行预培养7天，预培养后在外植体表面划出切口，置于含有转化载体的农杆菌菌液中进行农杆菌侵染，侵染完成后，置于共培养基上暗培养5天；暗培养完成后采用固液固交替培养方式进行筛选培养；固液固交替培养具体为，先转移至固体筛选培养基中培养5天，然后转移至液体筛选培养基中光照振荡培养18‑28天直至开始分化出幼苗雏形，再转移至固体筛选培养基中培养7‑10天直至分化出绿色完整幼苗。本设计能够将春兰从类原球茎分化为完整幼苗的时间由原本3‑6个月缩短至55‑65天，大大缩短春兰外植体分化成苗的时间，并且具有高分化率和转化效率，保证了稳定转化。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程，具体涉及一种高效获得春兰转基因苗的方法。

技术介绍

1、春兰的营养生长周期长，生长速度慢，难以进行遗传转化。从春兰幼苗到开花大概需要2-3年时间，前人对春兰进行转基因性状改良往往采用固体培养基上自然成苗，该方法成苗速度十分缓慢，转化效率低，而且会受到农杆菌的反噬，以及植株褐化或白化的限制，难以快速培养。所以，探究高效的春兰转化技术，改良春兰的遗传转化步骤，使其具备繁殖速度快、周期短、转化效率高、可规模化生产等优点刻不容缓。

技术实现思路

1、本专利技术的目的是针对现有技术存在的上述问题，提供一种分化时间短且能够保证稳定转化的高效获得春兰转基因苗的方法。

2、为实现以上目的，本专利技术的技术方案如下：

3、一种高效获得春兰转基因苗的方法，所述方法包括以下步骤：

4、s1、以春兰类原球茎作为外植体，将外植体置于预培养基中进行预培养7天；

5、s2、在预培养后的外植体表面划出切口，将其置于含有转化载体的农杆菌菌液中进行农杆菌侵染，将农杆菌侵染完成后的外植体置于共培养基上进行暗培养5天；

6、s3、将暗培养完成后的外植体进行筛选培养，分化得到绿色幼苗，计算幼苗分化率；其中，所述筛选培养采用固液固交替培养方式，具体步骤为：将暗培养完成后的外植体先转移至固体筛选培养基中培养5天，然后转移至液体筛选培养基中光照培养18-28天，分化出幼苗雏形时转移至固体筛选培养基中培养10天。

7、s2中，先将表

8、所述农杆菌菌液的培养步骤为：向yeb培养基加入含有转化载体的农杆菌菌液，振荡培养至吸光度值od600为0.5-0.7。

9、所述固液固交替培养中，每次转移外植体时均使用含有350mg/l头孢霉素的无菌水清洗外植体3-4次。

10、所述固体筛选培养基的配方包括：ms 4.74g/l+蔗糖35g/l+6-ba 8.0mg/l+naa0.1mg/l+tdz 0.3mg/l+头孢霉素350mg/l+潮霉素5mg/l+活性炭1.5g/l+琼脂10g/l，ph＝5.8；

11、所述液体筛选培养基的配方包括：ms 4.74g/l+蔗糖35g/l+6-ba 8.0mg/l+naa0.1mg/l+tdz 0.3mg/l+头孢霉素350mg/l+潮霉素5mg/l+活性炭0.4g/l，ph＝5.8。

12、所述共培养基的配方包括：ms 4.74g/l+蔗糖35g/l+6-ba 8.0mg/l+naa 0.1mg/l+tdz 0.3mg/l+活性炭粉末1.5g/l+琼脂10g/l，ph＝5.8。

13、所述预培养步骤具体为：将春兰类原球茎转移至液体预培养基中光照培养7天，至春兰类原球茎形状不规则。

14、所述预培养基的配方包括：1/2ms粉末2.47g/l+蔗糖35g/l+6-ba 0.4mg/l+naa1.2mg/l+活性炭粉末0.4g/l，ph为5.8。

15、所述生根壮苗培养基的配方包括：ms 4.74g/l+蔗糖35g/l+6-ba 8.0mg/l+naa0.1mg/l+香蕉泥80g/l+头孢霉素350mg/l+潮霉素10mg/l+活性炭1.5g/l+琼脂10g/l，ph＝5.8。

16、所述方法还包括步骤s4：

17、s4、将分化出的幼苗转移到生根壮苗培养基上培养10天，培养结束后得到完整的春兰植株，提取春兰植株dna进行pcr检测，计算转化效率。

18、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：

19、1、本专利技术一种高效获得春兰转基因苗的方法，对春兰外植体依次经过预培养、农杆菌侵染、暗培养、筛选培养获得转基因幼苗；该方法通过将类原球茎作为春兰遗传转化的外植体，以及在筛选培养中采用固液固交替培养方式，不仅能够将春兰从类原球茎分化为完整幼苗的时间由原本3-6个月缩短至55-65天，大大缩短春兰外植体分化成苗的时间，并且具有高分化率和转化效率，从而保证稳定转化。

20、2、本专利技术一种高效获得春兰转基因苗的方法中，将目的片段插入长度控制在500-1000bp，能够提高转化效率，从而保证获得稳定的春兰转基因苗。

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【技术保护点】

1.一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

3.根据权利要求1或2所述的一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

4.根据权利要求1或2所述的一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

5.根据权利要求1或2所述的一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

6.根据权利要求1或2所述的一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

7.根据权利要求1或2所述的一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

8.根据权利要求6所述的一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

9.根据权利要求1或2所述的一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

10.根据权利要求1或2所述的一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

【技术特征摘要】

1.一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

3.根据权利要求1或2所述的一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

4.根据权利要求1或2所述的一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

5.根据权利要求1或2所述的一种高效获得春兰转基因苗的方法，其特征在于：

6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：周银，肖政，贺思思，
申请(专利权)人：武汉商学院，
类型：发明
国别省市：

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