【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物，具体涉及的是一种壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌的制备方法及应用。
技术介绍
1、石油烃降解菌广泛存在于海洋海水中，国内外学者从海洋里筛选出海洋石油烃降解菌，开发了多种海洋石油污染消油产品，部分学者甚至开展了海上石油污染模拟修复试验，结果表明利用石油烃降解菌修复海上石油污染具有广阔的应用前景。
2、海洋是一个运动、开放的体系，使得传统生物修复技术存在菌体易流失、易被稀释、不利环境下易受到抑制等缺陷。固定化微生物技术是一种通过物理或化学手段将特选的游离菌固定在载体上，使菌体高度密集并保留原有微生物活性的新型技术。这种新型技术与传统游离微生物降解技术相比，具有微生物流失少、菌种密度高、环境耐受性好、反应速度快、降解性能好、运行稳定等优点。张建民等（张建民，杨锐龙，陈希，等. 改性载体固定化石油降解菌的制备及降解性能[j]. 纺织高校基础科学学报，2018，31(3)：378-385.）以凹凸棒石固定化石油降解菌进行降解性能测定，比游离菌种降解效果提高了12%；宋佳宁等（宋佳宁，刘思敏，刘玉龙. 固定化高效石油降解生物制剂制备及效果评价[j]. 油气田环境 保护，2018，28（1）：21-24）选取聚丙烯工业吸油棉为固定化生物载体材料，制备出适用于溢油污染海岸线环境的固定化高效石油降解生物制剂，环境耐受性及原油降解效率显著提升。huachun xu等（huachun x, yanan w, xinmiao x, et al
3、固定化载体可以为微生物的生长繁殖提供稳定的环境，常用的固定化载体有天然载体材料、合成高分子载体、人工无机载体等，壳聚糖因具有固定操作简单、生物相容性好、机械力学性能好、多孔结构等优点，作为载体环境友好可自然降解，还可大大提高环境耐受性，广泛应用于各种应用微生物的固定化载体。屈瑾等（屈瑾，陈银燕，赵若瑾，等. 壳聚糖固定化气单胞菌处理餐厨高油脂废水[j]. 生物工程学报，2021，37（4）：1-10）以壳聚糖为固定化载体，通过包埋法制备获得了壳聚糖-气单胞菌小球，菌株的生存能力和油脂降解效率显著提高，油脂降解效率显著提高了40%。此外，张国志（张国志. 壳聚糖/表面活性剂消油体系的筛选及评价[d]. 大连理工大学，2017）选择壳聚糖作为溢油分散剂助剂，大大提高了溢油分散剂制备的油水乳化稳定性。利用这一特性，以壳聚糖为固定化载体的同时，也可作为溢油分散剂助剂，将化学修复法和生物修复法结合起来，优化菌剂体系，开发高效消油产品。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌的制备方法及应用，以受污染海域筛选得到的高效碳九芳烃降解菌作为菌种来源，以壳聚糖为载体制备得到壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌，用以改善游离微生物降解不稳定的缺陷，并应用于对碳九芳烃的降解。
2、为了达成上述目的，本专利技术的解决方案是：
3、一种壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌的制备方法，包括以下步骤：
4、步骤1、先取受污染海域的海水，筛选出碳九芳烃降解菌菌种；
5、步骤2、然后将实验室筛选获得的碳九芳烃降解菌菌种于lb液体培养基活化后，取5 ml菌液加入到95 ml碳九芳烃培养基中，放入恒温摇床，在25~30 ℃下、150 r/min震荡培养3~5 天，接着取培养好的100 ml菌液放入离心管中，放入低温离心机中，在3000 r/min下离心5~10 min后，取出离心管去掉上清液，得到的下层菌体沉淀物用无菌生理盐水混匀制备成碳九芳烃降解菌菌悬液，于4 ℃冰箱中保存备用；
6、步骤3、然后称取3 g壳聚糖粉末，加入一定量的1%乙酸溶液搅拌，直至溶液均一透明，得到壳聚糖乙酸溶解液；
7、步骤4、然后取无水乙醇与配置好的0.05 g/ml naoh溶液，按照1:3~5的体积比混匀，用注射器取步骤3的壳聚糖乙酸溶解液缓慢滴入，固化5~8 h，得到壳聚糖载体小球；
8、步骤5、然后取壳聚糖载体小球与配置好的体积分数为3%戊二醛溶液，按照质量:体积=1:2~4的比例混匀，得到交联溶液，在35~45℃下进行壳聚糖与戊二醛的交联反应，反应3~5 h；
9、步骤6、然后将碳九芳烃降解菌菌悬液用振荡器混合均匀后，加入到步骤5的交联溶液中固化5~8 h，得到壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌，用磷酸盐缓冲液清洗干净表面后，于4 ℃冰箱中保存备用。
10、步骤1中，所述碳九芳烃降解菌菌种的筛选步骤为：先将取样海水摇匀后，取15 ml海水样品加入185 ml人工海水培养基中，加入2 ml碳九芳烃作为碳源，于25~30℃、150 r/min恒温摇床中培养7 天，之后从中吸取15 ml富集培养液转入185 ml新鲜人工海水培养基中，依次类推，富集培养3次；将第3次富集培养液梯度稀释后涂布于lb平板培养基中，于30℃恒温培养箱中培养48 h，观察菌落形态，然后用接种环从lb平板培养基中挑取不同形态的单菌落，用平板划线法进一步分离纯化，对分离得到的微生物进行涂片观察，显微镜下确认无杂菌后，接种到lb斜面，于4 ℃冰箱中保存，并将纯化菌种与甘油按照1:1的质量体积比混匀后保存于-80℃低温冰箱中；然后将纯化好的菌种于lb液体培养基活化后，分别取5ml培养液加入到95 ml碳九芳烃培养基中，对照组添加5 ml灭活的培养液，于25~30℃、150r/min恒温摇床中培养7 天，观察碳九芳烃乳化降解情况，并测定碳九芳烃降解率，筛选出降解性能好的碳九芳烃降解菌菌种。
11、步骤1中，所述lb平板培养基的配制方法为：氯化钠，10.0 g；蛋白胨，10.0 g；酵母提取物5.0 g；琼脂粉，20.0 g；ph 7.0；121℃高压蒸汽灭菌20 min备用。
12、步骤1中，所述人工海水培养基的配制方法为：称取nacl，30 g；na2hpo4，2 g；nah2po4，2 g；kh2po4，2 g；kcl，1 g；mgso4·7h2o，1 g；(nh4)2so4，1 g；移取微量元素溶液2.0ml；用蒸馏水定容至1 l；调节ph 7.0；用高压灭菌锅高压蒸汽灭菌备用。
13、所述微量元素溶液的组成为：fecl3，35 mg/l；cacl2，20 mg/l；znso4·7h2o，20mg/l；mnso4·7h2o，1 mg/l；cuso4，1 mg/l。
14、步骤2中，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述碳九芳烃降解菌菌种的筛选步骤为：先将取样海水摇匀后，取15 mL海水样品加入185 mL人工海水培养基中，加入2 mL碳九芳烃作为碳源，于25~30℃、150 r/min恒温摇床中培养7 天，之后从中吸取15 mL富集培养液转入185 mL新鲜人工海水培养基中，依次类推，富集培养3次；将第3次富集培养液梯度稀释后涂布于LB平板培养基中，于30 ℃恒温培养箱中培养48 h，观察菌落形态，然后用接种环从LB平板培养基中挑取不同形态的单菌落，用平板划线法进一步分离纯化，对分离得到的微生物进行涂片观察，显微镜下确认无杂菌后，接种到LB斜面，于4 ℃冰箱中保存，并将纯化菌种与甘油按照1:1的质量体积比混匀后保存于-80℃低温冰箱中；然后将纯化好的菌种于LB液体培养基活化后，分别取5 mL培养液加入到95 mL碳九芳烃培养基中，对照组添加5 mL灭活的培养液，于25~30℃、150 r/min恒温摇床中培养7 天，观
3.根据权利要求1所述的一种壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述LB平板培养基的配制方法为：氯化钠，10.0 g；蛋白胨，10.0 g；酵母提取物5.0 g；琼脂粉，20.0 g；pH 7.0；121℃高压蒸汽灭菌20 min备用。
4.根据权利要求1所述的一种壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述人工海水培养基的配制方法为：称取NaCl，30 g；Na2HPO4，2 g；NaH2PO4，2 g；KH2PO4，2 g；KCl，1 g；MgSO4·7H2O，1 g；(NH4)2SO4，1 g；移取微量元素溶液2.0 mL；用蒸馏水定容至1 L；调节pH 7.0；用高压灭菌锅高压蒸汽灭菌备用。
5.根据权利要求1所述的一种壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌的制备方法，其特征在于：所述微量元素溶液的组成为：FeCl3，35 mg/L；CaCl2，20 mg/L；ZnSO4·7H2O，20 mg/L；MnSO4·7H2O，1 mg/L；CuSO4，1 mg/L。
6.根据权利要求1所述的一种壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述LB液体培养基的配制方法为：氯化钠，10.0 g；蛋白胨，10.0 g；酵母浸膏5.0g；加水至1 L；调节pH 7.0；用高压灭菌锅高压蒸汽灭菌备用。
7.根据权利要求1所述的一种壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述碳九芳烃培养基的配制方法为：量取灭菌后的人工海水培养基200 mL，加入2mL、1%（v/v）的碳九芳烃作为唯一碳源，选择正丙苯、异丙苯、甲基乙基苯、三甲苯4种重整芳烃，各重整芳烃的体积含量比例为25%。
8.一种壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌的应用，是将如权利要求1所述的壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌应用于海上石油污染的修复。
...【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述碳九芳烃降解菌菌种的筛选步骤为：先将取样海水摇匀后，取15 ml海水样品加入185 ml人工海水培养基中，加入2 ml碳九芳烃作为碳源，于25~30℃、150 r/min恒温摇床中培养7 天，之后从中吸取15 ml富集培养液转入185 ml新鲜人工海水培养基中，依次类推，富集培养3次；将第3次富集培养液梯度稀释后涂布于lb平板培养基中，于30 ℃恒温培养箱中培养48 h，观察菌落形态，然后用接种环从lb平板培养基中挑取不同形态的单菌落，用平板划线法进一步分离纯化，对分离得到的微生物进行涂片观察，显微镜下确认无杂菌后，接种到lb斜面，于4 ℃冰箱中保存，并将纯化菌种与甘油按照1:1的质量体积比混匀后保存于-80℃低温冰箱中；然后将纯化好的菌种于lb液体培养基活化后，分别取5 ml培养液加入到95 ml碳九芳烃培养基中，对照组添加5 ml灭活的培养液，于25~30℃、150 r/min恒温摇床中培养7 天，观察碳九芳烃乳化降解情况，并测定碳九芳烃降解率，筛选出降解性能好的碳九芳烃降解菌菌种。
3.根据权利要求1所述的一种壳聚糖固定化碳九芳烃降解菌的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述lb平板培养基的配制方法为：氯化钠，10.0 g；蛋白胨，10.0 g；酵母提取物5.0 g；琼脂粉，20.0 g；ph 7.0；121℃高压蒸汽灭菌20 min备用。
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