【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞外囊泡itgb1的检测，具体为一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡itgb1的方法。
技术介绍
1、近年来，“液体活检”在肿瘤早筛、治疗选择、复发监测以及生物制药等方面受到越来越多的关注，成为辅助肿瘤诊疗的重要手段。目前，“液体活检”主要包括循环肿瘤细胞、循环肿瘤dna、细胞外囊泡、肿瘤教育血小板、循环肿瘤rna等。然而，仅有少量技术应用于临床。其中，细胞外囊泡是由细胞分泌的脂质分子层囊泡，能够携带核酸、蛋白和脂质等生物活性分子，参与细胞间的通讯。由于细胞外囊泡具有易富集、稳定性高、内容物丰富、分布性广，比传统的分子标志物更具有特异性等优势，它能及时监测分子标志物变化，有利于疾病的早期诊断及治疗疗效监测，被认为是液体活检领域的“三驾马车之一”。
2、值得注意的是，细胞外囊泡中含有一类重要的蛋白家族，即整合素蛋白。细胞外囊泡整合素在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和肺癌转移模型中，对器官性转移具有重要的提示作用。已有较多研究成果表明，整合素家族分子可作为癌症的潜在筛选标志物，并可提示患者的预后。如整合素α6β1可能与肺转移有关，而整合素αvβ5可能与肝转移有关。itgb1作为重要的癌症生物学标志物，准确测定其含量具有重要的临床价值。
3、目前，检测细胞外囊泡蛋白表达水平常用的方法有蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附实验、流式细胞术等，但存在以下问题：1)wb耗时耗力，且没有统一的参考标准，不能满足临床应用的需求；2)elisa法检测生物活性分子存在稳定性差、操作繁琐、检测敏感性不足，检测线性范围受限等
4、为此，我们研发出了新的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡itgb1的方法。
技术实现思路
1、(一)解决的技术问题
2、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡itgb1的方法，用高特异性，高亲和力的抗体去识别itgb1抗原，用单分子免疫技术检测细胞外囊泡itgb1的含量，解决了现有技术中检测细胞外囊泡蛋白的不准确性，灵敏度低，检测方法繁琐等问题。
3、(二)技术方案
4、为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡itgb1的方法，包括以下具体步骤：
5、步骤一：采用超高速离心法提取血清细胞外囊泡；
6、步骤二：配置磁珠偶联液，准备itgb1捕获抗体，并制备itgb1捕获抗体磁珠复合物；
7、步骤三：配置标记偶联液，制备itgb1检测抗体微球复合物；
8、步骤四：将itgb1捕获抗体与血清细胞外囊泡结合；
9、步骤五：洗涤，去除未结合的游离抗原；
10、步骤六：将itgb1检测抗体与结合有捕获抗体的细胞外囊泡结合；
11、步骤七：洗涤，去除多余的未结合的检测抗体－荧光微球复合物；
12、步骤八：重悬反应体系，加入微流控芯片中，置于单分子荧光免疫分析仪中，完成血清细胞外囊泡itgb1的检测和结果分析。
13、优选的，所述提取的血清细胞外囊泡来源于健康人或结直肠癌患者。
14、优选的，所述itgb1捕获抗体磁珠复合物包括磁珠和捕获抗体，所述磁珠为羧基磁珠，磁珠粒径为2-3μm；
15、所述捕获抗体为itgb1兔源多抗，其与抗原的结合效率较高，捕获抗体的浓度为0.05—0.3mg/ml时，检测的灵敏度较佳。
16、优选的，所述itgb1检测抗体微球复合物包括荧光微球和检测抗体，所述荧光微球的材质为聚苯乙烯，微球粒径为150-300nm，其中，当采用200nm羧基荧光微球时，evs-itgb1的检测灵敏度和准确度达到最佳；
17、检测抗体为itgb1单克隆兔源抗体，最佳抗原抗体结合浓度为0.2mg/ml时，其与抗原的结合效率较高，检测的灵敏度较佳。
18、优选的，所述标记偶联液浓度为10-200mm，且标记偶联液包括tris缓冲液、磷酸缓冲液、mes缓冲液、mopes缓冲液、hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上。
19、(三)有益效果
20、本专利技术提供了一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡itgb1的方法。具备以下有益效果：
21、该种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡itgb1的方法，通过采用化学修饰的方法将羧基修饰到磁珠表面，磁珠活化后，与itgb1捕获抗体发生偶联，形成稳定的共价键，组成检测抗体－磁珠复合物；以荧光微球作为itgb1检测抗体的偶联载体，组成检测抗体－磁珠复合物，加入待测样本后，最终形成双抗体夹心复合物。进而通过单分子荧光免疫分析仪对形成的抗原抗体复合物进行逐个计数，进行定量分析，与现有技术相比，其采用高特异性、高亲和力的抗体去识别itgb1抗原，用单分子免疫技术检测细胞外囊泡itgb1的含量，该方法灵敏度极高，尤其适合细胞外囊泡蛋白的痕量检测，特异性好，且操作简便，检测快速高效、检测样本消耗量少，价格经济实惠，具有广泛推广的潜力，克服现有技术中检测细胞外囊泡蛋白的不准确性，灵敏度低，检测方法繁琐等问题。
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1.一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡ITGB1的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡ITGB1的方法，其特征在于：所述提取的血清细胞外囊泡来源于健康人或结直肠癌患者。
3.根据权利要求1所述的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡ITGB1的方法，其特征在于：所述ITGB1捕获抗体磁珠复合物包括磁珠和捕获抗体，所述磁珠为羧基磁珠。
4.根据权利要求1所述的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡ITGB1的方法，其特征在于：所述磁珠粒径为2-3μm。
5.根据权利要求1所述的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡ITGB1的方法，其特征在于：所述捕获抗体为ITGB1兔源多抗。
6.根据权利要求1所述的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡ITGB1的方法，其特征在于：所述捕获抗体的浓度为0.05—0.3mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡ITGB1的方法，其特征在于：所述ITGB1检测抗体
8.根据权利要求7所述的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡ITGB1的方法，其特征在于：所述微球粒径为150-300nm。
9.根据权利要求1所述的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡ITGB1的方法，其特征在于：所述检测抗体为ITGB1单克隆兔源抗体，所述抗原抗体结合浓度为0.2mg/mL。
10.根据权利要求1所述的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡ITGB1的方法，其特征在于：所述标记偶联液浓度为10-200mM，所述标记偶联液包括Tris缓冲液、磷酸缓冲液、MES缓冲液、MOPES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上。
...【技术特征摘要】
1.一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡itgb1的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡itgb1的方法，其特征在于：所述提取的血清细胞外囊泡来源于健康人或结直肠癌患者。
3.根据权利要求1所述的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡itgb1的方法，其特征在于：所述itgb1捕获抗体磁珠复合物包括磁珠和捕获抗体，所述磁珠为羧基磁珠。
4.根据权利要求1所述的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡itgb1的方法，其特征在于：所述磁珠粒径为2-3μm。
5.根据权利要求1所述的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡itgb1的方法，其特征在于：所述捕获抗体为itgb1兔源多抗。
6.根据权利要求1所述的一种基于单分子免疫检测技术测定细胞外囊泡itgb1的方法，其特征在于：所述捕获抗体的浓...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕丽华，李明，祝言言，朱琦，
申请(专利权)人：安徽省立医院中国科学技术大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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