【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及反式剪接rna（tsrna）分子，其包含与至少一个或多个前体信使rna（前mrna）靶标互补的至少一个或多个非结构化靶标结合结构域，并且适于通过包含安全结构域来防止脱靶反式剪接；包含所述tsrna的细胞或载体或治疗剂或组合物或药物组合物；以及使用所述tsrna用于杀伤细胞或治疗疾病或用于成像或用于化妆品应用的方法。本专利技术可用于医学、化妆品和兽医领域。
技术介绍
1、剪接体介导的rna反式剪接（smart）是这样的过程，通过所述过程两个不同的前体信使rna（前mrna）或其他可剪接rna反式连接以在细胞核中生成嵌合rna分子，在输出细胞核后，其触发在细胞质中形成嵌合蛋白。此技术可以用于例如通过用完整的外显子替代突变的外显子来修复有缺陷的rna，或者可以用于用功能序列来标记内源信息。此功能序列可以触发杀伤靶细胞的死亡信号、对靶细胞成像的荧光蛋白、治疗或治愈靶细胞的治疗性或化妆品蛋白、或对靶细胞编程/重编程的任何目的基因的表达。
2、基于反式剪接的修复难以实现，因为持久的修复需要连续地递送或在基因组整合后内源性地表达反式剪接rna，它还需要针对靶标内的预期剪接位点的精确剪接，并且尽管与常规的顺式剪接有强烈的竞争，但它必须足够有效以触发治疗表型。
3、用功能序列进行基于反式剪接的标记涉及例如编码在活细胞中监测基因表达的荧光蛋白或在自杀基因疗法方法中选择性地触发表达异常转录物的细胞的死亡的死亡信号的rna。异常转录物可以是患病细胞的生物标志物，如癌症特有的癌基因的转录物或病毒转录物。死亡信号可以由
4、作为疗法，反式剪接触发的细胞死亡比基于反式剪接的修复更容易实现，因为反式剪接构建体只需要递送到靶细胞中一次，因此不需要长期表达。此外，选择性中靶反式剪接（即，针对正确的靶标但涉及该靶标的任何剪接位点的反式剪接）不是不利的，反而有助于靶标特异性死亡信号，并且反式剪接不需要高度有效以触发足够强以杀伤靶细胞的信号。
5、基于hsvtk/gcv系统，我们已经开发了一种有效的基于反式剪接的自杀基因疗法方法。我们已经设计了新的反式剪接rna，用于5'和3'外显子替代（er）两者，即用于将自杀基因或自杀基因系统的组分（如hsvtk）附接至靶信息的5'或3'端。我们已经研究了rna结构设计以提高反式剪接rna（tsrna）的中靶活性和特异性两者。
6、如以下的方法的效率取决于离体地或在体内将重组dna递送到原代细胞中以便触发非编码rna或蛋白质的表达：遗传性和获得性遗传病的基因疗法、基因疫苗接种、干细胞编程、体细胞重编程、免疫疗法和蛋白质表达的操纵以及基于反式剪接的体内自杀基因疗法。在原代细胞中，重组外来附加体dna（如质粒）的表达在递送后24小时内被沉默，不依赖于递送途径。对此效应的潜在机制知之甚少。只有整合病毒递送载体（如逆转录病毒、慢病毒和aav载体）已经成功地用于触发原代细胞中的中期和长期表达。然而，考虑到现行良好操作规范（cgmp）生产标准，这些载体是昂贵的。认为在cgmp标准下产生病毒载体比生成等量的“裸”遗传物质贵若干数量级。此外，病毒载体具有安全风险和问题，其与 (i) 整合的外来dna在整合的基因座处的负干扰（例如，基因功能和调节的破坏）和 (ii) 源自病原性病毒的组分的参与相关。可替代地，将功能性rna直接递送到原代细胞中导致快速降解并且仅提供短期效应。因此，强烈需要开发逃避转基因沉默的新型遗传载体。
7、本公开文本允许在原代细胞中持续且安全的转基因表达，解决了转基因沉默的问题。
8、仅由包含启动子、编码基因和rna稳定序列的转录单位组成的新型载体（如dna微环或哑铃形载体）由于大小小而具有若干优点，如改善的细胞递送或细胞核扩散。此外，由于共价闭合结构，这些小载体对外切核酸酶具有抗性，而质粒通常具有由剪切力触发的单链断裂（所谓的切口）。不必要的细菌序列或抗性蛋白的缺乏消除了宿主中不想要的副作用，并且受控的体外合成以及将荧光团、细胞穿透肽或免疫刺激肽化学连接至环结构的选择允许容易地操纵这些载体。哑铃形dna载体（有时称为哑铃、狗骨dna或闭合端dna）包含(i) 双链dna核心，其包含待递送的任何一种或多种目的基因以及调节序列，如启动子、增强子、核定位信号、转录终止或多腺苷酸化信号；以及 (ii) 使两侧的末端闭合的单链环结构。如上所述，质粒中的转基因沉默是频繁的。已表明在转基因表达盒的5'与3'端之间缺乏基因外间隔子的dna微环允许在小鼠中持续的转基因表达。当与微环相比时，哑铃形载体（特别是用于表达小非编码rna的那些）在分子量方面可以小一个数量级。wo 2012/032114披露了包含哑铃形环状载体的dna表达构建体，其在注射到黑色素瘤中后维持七天表达。与任何其他遗传载体相对照，哑铃的特征可以在于具有辅助官能团（function），用于经由环进行靶向递送、成像、免疫传感等。
9、本公开文本涉及用于靶向递送的新型哑铃载体缀合物。我们提出了尤其与三触角n-乙酰半乳糖胺(galnac)3（用于靶向递送到包括肝细胞在内的脱唾液酸糖蛋白阳性细胞中）缀合的哑铃载体。我们进一步提出了与适配体（即，靶向cd137和前列腺特异性膜抗原（psma）的适配体）缀合的哑铃载体。(galnac)3和适配体两者都经由互补碱基配对非共价连接至扩大的哑铃环结构。
技术实现思路
1、根据本专利技术的第一方面，提供了一种反式剪接rna（tsrna）分子，所述反式剪接rna分子包含：
2、a)至少一个但优选多个结合结构域，所述结合结构域对与待治疗的细胞或患病细胞相关或是其生物标志物的基因的至少一部分具有特异性；和
3、b)编码至少一种或多种可表达的以下的核酸：
4、(i)自杀蛋白或作为自杀系统的组分的蛋白质；或
5、(ii)荧光蛋白、萤光素酶或另一种报告蛋白；或
6、(iii)治疗性蛋白；和
7、c)至少一个剪接信号；以及
8、d)对反式剪接rna内的剪接信号具有特异性的至少一个安全结构域。
9、在本专利技术的优选实施方案中，所述结合结构域包含结合位点，其包含至少25个、更优选35个、甚至更优选45个、最优选55个或更多个连续非结构化核苷酸（nt），不具有内部结合和/或自互补序列；并且当长度为44 nt或更长时，所述结合结构域相对于所述基因具有至少一个或多个错配核苷酸。
10、在本专利技术的优选实施方案中，部分b) i-iii中的任何一个或多个（包括全部）（包括本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种反式剪接RNA（tsRNA）分子，所述反式剪接RNA分子包含：
2. 根据权利要求1所述的反式剪接RNA（tsRNA）分子，其中：所述结合结构域包含结合位点，所述结合位点包含至少25、35、45、55个或更多个连续非结构化核苷酸（nt），不具有内部结合和/或自互补序列；并且当长度为44 nt或更长时，所述结合结构域相对于所述基因具有至少一个或多个错配核苷酸。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的反式剪接RNA（tsRNA）分子，其中：所述安全结构域是对所述剪接信号中的剪接位点具有特异性的反义结合结构域，借此所述安全结构域防止脱靶反式剪接。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的反式剪接RNA（tsRNA）分子，其中所述安全结构域是线性核酸序列，称为连续安全结构域；或包含一个或多个折叠的折叠核酸序列，称为分段安全结构域。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的反式剪接RNA分子，其中所述tsRNA进一步包含：
6. 根据前述权利要求中任一项所述的反式剪接RNA分子，其中所述生物标志物是选自以下的任何单一生物标志物或生
7.根据前述权利要求中任一项所述的反式剪接RNA分子，其中所述至少一种或多种自杀蛋白或作为自杀系统的组分的至少一种或多种蛋白质选自下组，所述组包含以下或由以下组成：HSVtk、CYLD赖氨酸63去泛素化酶（CYLD）、肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子（TWEAK）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1. 一种反式剪接rna（tsrna）分子，所述反式剪接rna分子包含：
2. 根据权利要求1所述的反式剪接rna（tsrna）分子，其中：所述结合结构域包含结合位点，所述结合位点包含至少25、35、45、55个或更多个连续非结构化核苷酸（nt），不具有内部结合和/或自互补序列；并且当长度为44 nt或更长时，所述结合结构域相对于所述基因具有至少一个或多个错配核苷酸。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的反式剪接rna（tsrna）分子，其中：所述安全结构域是对所述剪接信号中的剪接位点具有特异性的反义结合结构域，借此所述安全结构域防止脱靶反式剪接。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的反式剪接rna（tsrna）分子，其中所述安全结构域是线性核酸序列，称为连续安全结构域；或包含一个或多个折叠的折叠核酸序列，称为分段安全结构域。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的反式剪接rna分子，其中所述tsrna进一步包含：
6. 根据前述权利要求中任一项所述的反式剪接rna分子，其中所述生物标志物是选自以下的任何单一生物标志物或生物标志物组合：癌症标志物，hcc生物标志物甲胎蛋白（afp）、血管内皮生长因子（vegf）、γ-谷氨酰转移酶（ggt）、肝细胞癌相关蛋白2（hcca2）、转化生长因子β1（tgf-β1）、分化群24（cd24）、周期蛋白d1（ccnd1）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（gpc3）、端粒酶逆转录酶（tert），α-l-岩藻糖苷酶（afu）、cd19、cd34、cd44、cd49e、cd51、cd105、xv型胶原蛋白α1（col15a1）、c-x-c基序趋化因子受体4（cxcr4）、无齿e3泛素蛋白连接酶同源物（dtl）、上皮细胞黏附分子（epcam）、高尔基体蛋白73（gp73）、g蛋白信号调节蛋白2（gpsm2）、肝细胞生长因子（hgf）、热休克蛋白70（hsp70）、胰岛素样生长因子2（igf2）、免疫球蛋白超家族成员3前体（igsf3）、整合素亚基α6（itga6）、kell血型糖蛋白（kel）、kit原癌基因、受体酪氨酸激酶（kit）、微型染色体维持复合物组分3（mcm3）、微型染色体维持复合物组分7（mcm7）、pdz连接激酶（pbk）、dna聚合酶δ1、催化亚基（pold1）、胞质分裂蛋白调节因子1（prc1）、sry盒转录因子17（sox17）、富含丝氨酸精子发生相关蛋白2（spats2）、易位子相关蛋白亚基β（ssr2）、抑微管装配蛋白1（stmn1）、凝血调节蛋白（thbd）、zw10相互作用动粒蛋白（zwint）、hbv衍生的rna包括hbv pgrna、eb病毒衍生的rna和前mrna包括bamhi z eb病毒复制激活蛋白（bzlf1）、eb病毒核抗原3b（ebna-3b）、潜伏膜蛋白1（lmp1）和潜伏膜蛋白2a（lmp2a）；表皮细胞标志物，包括角蛋白1（krt1）、角蛋白2（krt2）、角蛋白10（krt10）、角蛋白14（krt14）、半胱天冬酶14前体（casp14）、神经母细胞分化相关蛋白2（ahnak2）；基底细胞标志物，包括角蛋白15（krt15）、胶原蛋白17a1（col17a1）、肿瘤蛋白73（tp73）；毛囊细胞标志物，包括同源异形框c13（hoxc13）和成纤维细胞生长因子7（fgf-7）；衰老细胞标志物，包括叉头框o4（foxo4）和周期蛋白依赖性激酶抑制因子2a（p16）；角质层标志物激肽释放酶相关肽酶5（klk5）、小脯氨酸丰富蛋白4（sprr4）和花生四烯酸-12-脂加氧酶（alox12b）；棘层（上表皮层）标志物hop同源异形框（hopx）和激肽释放酶9（klk9）；颗粒层标志物聚丝蛋白（flg）和卵巢早衰1b蛋白（pof1b）；黑素细胞标志物melan-a（mlana）和酪氨酸酶（tyr）；朗格汉斯细胞标志物cd1a和cd207；成纤维细胞标志物骨膜蛋白（postn）和磷脂酶c-η-2蛋白（plch2）；基底细胞癌标志物神经胶质瘤1（gli1）、神经胶质瘤2（gli2）、叉头框蛋白（foxm1）、叉头框蛋白（foxo3a）、桥粒黏蛋白2（dsg2）和c3b；基底细胞癌复发标志物环氧合酶（cox-2）、埃兹蛋白（ezr）、cd25、乳腺丝抑蛋白、神经胶质瘤3（gli3）、galnac3和gremlin1。
7.根据前述权利要求中任一项所述的反式剪接rna分子，其中所述至少一种或多种自杀蛋白或作为自杀系统的组分的至少一种或多种蛋白质选自下组，所述组包含以下或由以下组成：hsvtk、cyld赖氨酸63去泛素化酶（cyld）、肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子（tweak）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（trail）和肿瘤坏死因子α（tnf-α）。
8.根据前述权利要求中任一项所述的反式剪接rna分子，其中所述疾病是癌症或病毒感染或细菌感染或遗传病。
9.根据权利要求8所述的反式剪接rna分子，其中所述癌症选自下组，所述组包含以下或由以下组成：肝细胞癌（hcc）、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌、黑色素瘤包括恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、梅克尔细胞癌、肺癌、细胞膀胱癌、乳腺癌、结肠或直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、白血病、急性髓细胞性或髓系白血病（aml）、急性成淋巴细胞性白血病（all）、慢性淋巴细胞白血病（cml）、慢性髓细胞性或髓系白血病（cml）、毛细胞白血病（hcl）、t细胞幼淋巴细胞白血病（p-tll）、大颗粒淋巴细胞白血病、成人t细胞白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、口腔或喉癌、口咽癌、鼻咽癌、胃癌、脑瘤、骨癌和干细胞癌。
10.根据权利要求8所述的反式剪接rna分子，其中所述病毒感染选自下组，所述组包含以下的感染或由以下的感染组成：逆转录病毒包括人嗜t淋巴细胞病毒（htlv）慢病毒、人类免疫缺陷病毒1型和2型（hiv-1和hiv-2），人乳头瘤病毒包括16型和18型（hpv-16和hpv-18），嗜肝dna病毒包括hav、hbv、hcv、hdv和hev，疱疹病毒包括单纯疱疹病毒（hsv），eb病毒（ebv），巨细胞病毒（cmv），腺病毒，腺相关病毒，流感病毒或整合病毒和鼻咽病毒。
11. 根据权利要求8所述的反式剪接rna分子，其中所述细菌感染选自下组，所述组包含由以下引起的感染或由由以下引起的感染组成：汉氏巴尔通体（bartonella henselae）、土拉弗朗西斯菌（francisella tularensis）、单核细胞增生李斯特菌（listeriamonocytogenes）、沙门氏菌属（salmonella）物种、伤寒沙门氏菌（salmonella typhi）、布鲁氏菌属（brucella）物种、军团菌属（legionella）物种、分枝杆菌属（mycobacteria）物种、结核分枝杆菌（mycobacterium tunberculosis）、诺卡氏菌属（nocardia）物种、红球菌属（rhodococcus）物种、耶尔森菌属（yersinia）物种和脑膜炎奈瑟氏菌（neisseriameningitides）。
12.根据权利要求8所述的反式剪接rna分子，其中所述获得性遗传病选自下组，所述组包含以下或由以下组成：神经纤维瘤病1型和2型、麦丘恩-奥尔布赖特综合征、迪谢内肌营养不良（dmd）、大疱性表皮松解症、范科尼综合征a型和c型、费城染色体、a型和b型血友病、囊性纤维化、穆-韦二氏综合征、脂蛋白脂酶缺乏症、b-地中海贫血、戈谢病i型至iii型-gba基因、鸟氨酸氨甲酰基转移酶（otc）缺乏症-otc、苯丙酮尿症（pku）-pah基因、天冬氨酰葡糖胺尿症-aga基因、α-1抗胰蛋白酶缺乏症（aatd）-serpina1和丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症。
13.根据前述权利要求中任一项所述的反式剪接rna分子，其中所述tsrna靶向鼻咽细胞或表...
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