【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种固定化酶及其在 d-塔格糖制备中的应用。
技术介绍
1、随着肥胖、糖尿病等慢性病在全球范围内漫延，人们健康意识的提高，“低糖饮食”成为新的健康课题。因此，研究开发新型功能性的甜味剂受到了广泛关注。d-塔格糖甜度高，热量低，还具有改善肠道菌群、降血糖、抗龋齿，预防肥胖等功效，可以作为理想功能性甜味剂代替蔗糖广泛应用于食品领域，同时还用作药用辅料应用于医药行业中。
2、d-塔格糖的生产主要有化学法和生物法两种，化学法能耗高，产物复杂，纯化困难，副反应多，污染大等缺点；生物法具有绿色安全等优点，故生物转化法具有较好的应用前景。在生物法中，通过酶工程制备d-塔格糖的工艺复杂、操作过程繁琐等，导致d-塔格糖合成途径的生产成本高昂，因此，亟需寻找一种反应周期缩短，成本低廉且产物得率高的生产 d-塔格糖的方法。
3、相关研究报道了生物法生产 d-塔格糖的方法，如专利文献 cn 116083505 a 公开了一种三酶级联法生产 d-塔格糖的方法，以果糖为底物利用果糖激酶 frk，d-塔格糖6-磷酸-4-差向异构酶 gatz 和 d-塔格糖-6-磷酸磷酸酶 mmpase 进行反应生产 d-塔格糖，使得 d-塔格糖的产率达到原来的 2.7-9 倍，提供了一种通过多酶级联的手段生产塔格糖的思路。申请文件公开了一种以乳糖为底物通过级联催化生产塔格糖的方法，工艺简单且拓展了底物来源，有助于降低塔格糖生产成本。专利文献 cn 112708616 b 公开了一种固定化多酶体系的制备方法及用于生产塔格
4、目前利用固定化酶技术生产d-塔格糖的研究已经取得一定进展，但是操作过程还需进一步简化，酶转化率有待进一步提升，以更好的应用于d-塔格糖的工业化生产。因此，本专利技术采用固定化双酶催化法制备d-塔格糖，主要是采用碳纳米管与纳米氧化锌修饰聚乙烯醇纳米纤维膜制备复合载体 zno/cnts/pva 进行固定化，获得固定化 l-阿拉伯糖异构酶和 β-半乳糖苷酶，并以乳糖为底物利用该固定化酶催化生产 d塔格糖。本技术专利技术的双酶催化法生产d-塔格糖的优点是能够缩短反应周期、减少反应成本，具有较高的应用价值，且适合于工业上广泛应用。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种双固定化酶及其在 d-塔格糖制备中的应用，采用碳纳米管与纳米氧化锌修饰聚乙烯醇纳米纤维膜制备复合载体 zno/cnts/pva 进行固定化，获得固定化 l-阿拉伯糖异构酶和 β-半乳糖苷酶，并以乳糖为底物利用该固定化酶催化生产 d塔格糖。
2、一种双固定化酶及其在 d-塔格糖制备中的应用，主要包括以下步骤：
3、利用碳纳米管与纳米氧化锌修饰聚乙烯醇纳米纤维膜制备复合载体，得到固定化载体 zno/cnts/pva；再以复合载体 zno/cnts/pva 双固定化 l-阿拉伯糖异构酶和 β-半乳糖苷酶，得到得到 zno/cnts/pva 固定化酶反应器；再以乳糖为底物，pbs 缓冲溶液为反应溶剂，利用 zno/cnts/pva 固定化酶反应器制备 d-塔格糖。
4、进一步的，所述 zno/cnts/pva 固定化载体的制备方法为：将纳米氧化锌和碳纳米管分别加入 aptes 溶液进行氨基修饰得到 zno/cnts 载体，再与聚乙烯醇纳米纤维膜pva 进行交联，得到 zno/cnts/pva 复合载体。
5、进一步的，所述聚乙烯醇纳米纤维膜 pva 的制备的方法为：将聚乙烯醇溶于热水得到 7-10% 的溶液，加入浓度为 4-6% 的十六烷基三甲基溴化铵，搅拌溶解；将配制好的溶液装入装有前端带有 22 g 不锈钢针的 2.5 ml 塑料注射器中，正极电压为 15 至 17kv，负极电压为 -1.5 至 -3 kv，接收距离 5-10 cm，湿度为 20-40%，室温下纺丝 8-10 h，干燥得到聚乙烯醇纳米纤维膜 pva。
6、进一步的，所述 zno/cnts/pva 固定化酶反应器的制备的方法为：将 zno/cnts/pva 复合载体加入到含有 0.5-1.5% 的戊二醛溶液中，再加入酶，得到 zno/cnts/pva 固定化酶反应器。
7、进一步的，所述 zno/cnts/pva 固定化酶反应器中所述的酶包括 l-阿拉伯糖异构酶和 β-半乳糖苷酶的一种或两种。
8、进一步的，所述 d-塔格糖的制备所述反应体系为：ph 6-7，温度 55-65℃，固定化酶与底物质量之比为 3-6 mg/ml。
9、进一步的，本专利技术中所述的 l-阿拉伯糖异构酶的来源为实验室制备得到，β-半乳糖苷酶为商品酶。
10、进一步的，所述所述的 l-阿拉伯糖异构酶的来源为解淀粉芽孢杆菌lw48bacillus amyloliquefaciens lw 48，已于2024年5月17日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 cctcc m 2024980。
11、本专利技术具有如下有益效果：
12、本专利技术所述方法制备双酶固定化的载体，大大降低的 d-塔格糖酶促反应的成本，其次，酶固定于载体上，避免了酶蛋白直接溶于反应液中带来的后续分离问题，降低了后续分离成本。本技术专利技术的双酶催化法生产d-塔格糖的优点是能够缩短反应周期、减少反应成本，具有较高的应用价值，且适合于工业上广泛应用。
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1.一种固定化酶，其特征在于，其制备包括以下步骤：首先，利用碳纳米管与纳米氧化锌修饰聚乙烯醇纳米纤维膜制备复合载体，得到 ZnO/CNTs/PVA 固定化载体；其次，将 D-塔格糖催化转化的关键酶加入 ZnO/CNTs/PVA 固定化载体中得到 ZnO/CNTs/PVA 固定化酶反应器，最后，以乳糖为底物，以 PBS 缓冲溶液为反应溶剂，利用 ZnO/CNTs/PVA 固定化酶反应器制备 D-塔格糖。
2.根据权利要求 1 所述的一种固定化酶，其特征在于，所述 ZnO/CNTs/PVA 固定化载体是将纳米氧化锌和碳纳米管以 1:1 的比例加入 APTES 溶液进行氨基修饰得到 ZnO/CNTs，再与聚乙烯醇纳米纤维膜 PVA 进行交联得到 ZnO/CNTs/PVA 固定化载体。
3.根据权利要求 2 所述的一种固定化酶，其特征在于，所述聚乙烯醇纳米纤维膜 PVA是通过以下步骤制备而得：将聚乙烯醇溶于热水得到7-10%的溶液，加入浓度为4-6%的十六烷基三甲基溴化铵，搅拌溶解；将配制好的溶液装入装有前端带有22 G不锈钢针的2.5 mL塑料注射器中，正极电压
4.根据权利要求 1 所述的一种固定化酶，其特征在于，所述 ZnO/CNTs/PVA 固定化酶反应器是将ZnO/CNTs/PVA 固定化载体加入到含有 0.5-1% 的戊二醛溶液中，再加入酶，得到 ZnO/CNTs/PVA 固定化酶反应器。
5.根据权利要求 1所述的一种固定化酶，其特征在于，所述的酶包括 L-阿拉伯糖异构酶和 β-半乳糖苷酶的一种或两种。
6.根据权利要求 1至5 所述的一种固定化酶及其在 D-塔格糖制备中的应用于生产D-塔格糖。
...【技术特征摘要】
1.一种固定化酶，其特征在于，其制备包括以下步骤：首先，利用碳纳米管与纳米氧化锌修饰聚乙烯醇纳米纤维膜制备复合载体，得到 zno/cnts/pva 固定化载体；其次，将 d-塔格糖催化转化的关键酶加入 zno/cnts/pva 固定化载体中得到 zno/cnts/pva 固定化酶反应器，最后，以乳糖为底物，以 pbs 缓冲溶液为反应溶剂，利用 zno/cnts/pva 固定化酶反应器制备 d-塔格糖。
2.根据权利要求 1 所述的一种固定化酶，其特征在于，所述 zno/cnts/pva 固定化载体是将纳米氧化锌和碳纳米管以 1:1 的比例加入 aptes 溶液进行氨基修饰得到 zno/cnts，再与聚乙烯醇纳米纤维膜 pva 进行交联得到 zno/cnts/pva 固定化载体。
3.根据权利要求 2 所述的一种固定化酶，其特征在于，所述聚乙烯醇纳米纤维膜 pva是通过以下步骤制备而得：...
【专利技术属性】
技术研发人员：王乐，陆厚珍，赵灿，吴郑松，郭敬源，桂海涛，
申请(专利权)人：河南工业大学，
类型：发明
国别省市：
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