【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及宿主蛋白残留检测试剂盒制备，具体为一种宿主蛋白残留检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
1、目前，用于hcp测定的方法主要是elisa法，elisa方法作为一种经典的方法,因其高灵敏度和特异性被广泛应用。药典2020版规定药物中宿主细胞蛋白质残留量用酶联免疫吸附法测定，应不高于蛋白质总量的0.01%。
2、在elisa中，非特异性吸附是值得注意的问题，如果抗原或抗体纯化不过关，产生非特异性吸附是实验操作中无法避免的。即使抗原抗体的纯化达到一定水平，还是有可能产生非特异性吸附。例如塑料载体表面的吸附，为了避免非特异性吸附，常规办法是采用含tween20的pbs或生理盐水作为洗脱液，另外，检测血清和酶标记抗体用含牛血清白蛋白溶液或明胶溶液，稀释也能得到增强特异性吸附的作用；本申请另辟蹊径从链霉亲和素入手，通过采用聚乳酸纳米颗粒作为核心，聚乙二醇桥接链霉亲和素，加强了链霉亲和素的特异性选择能力，提高了试剂盒的灵敏性，并且其不是从抗体-抗原上着手，而是从链霉亲和素和生物素之间结合能力入手，使该种方法适应范围更广。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种宿主蛋白残留检测试剂盒及其制备方法，以解决现有技术中存在的问题。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种宿主蛋白残留检测试剂盒，包括：包被有抗hcp蛋白抗体的酶标板、生物素标记的抗体、链霉亲和素改性纳米颗粒和辅助制剂；
4、所述链霉亲和素改性纳米颗粒
5、s1、将活性酯-聚乙二醇-活性酯和甲氧基-聚乙二醇-活性酯按照质量比1：1.2~1.5，进行混合搅拌均匀，制备成混合溶液备用；将改性聚乳酸纳米微球加入至改性聚乳酸纳米微球质量4~4.5倍的混合溶液中，搅拌均匀，并加入改性聚乳酸纳米微球质量0.01~0.05倍的三乙胺，搅拌均匀，静置反应20~25min后，过滤并将过滤产物用n，n-二甲基甲酰胺和无水乙醇分别洗涤2~3次后，再用离子水洗涤，制备成改性纳米颗粒；
6、s2、将改性纳米颗粒加入至改性纳米颗粒质量6~8倍的mes缓冲溶液中，加入改性纳米颗粒质量0.05~0.08倍的链霉亲和素，并在温度为0~5℃条件下，摇床孵育2~3h，用mes溶液离心洗涤2~3次后，制得链霉亲和素改性纳米颗粒。
7、作为优化，所述链霉亲和素改性纳米颗粒采用改性聚乳酸纳米微球通过活性酯-聚乙二醇-活性酯桥接链霉亲和素制得。
8、作为优化，所述辅助制剂包括：ph为9.6的碳酸盐缓冲液、tmb显色液和终止液。
9、作为优化，所述终止液为硫酸或盐酸。
10、作为优化，所述聚乳酸纳米微球包括以下制备步骤：将聚乳酸加入至聚乳酸质量65~70倍的二氯甲烷中，搅拌均匀，制备成聚乳酸溶液备用；将明胶加入至明胶质量330~340倍的去离子水中，搅拌均匀，制备成明胶溶液备用；在温度为25~35℃，转速为1800rmp条件下，于0.8~1h内将聚乳酸溶液滴加入至明胶水溶液中，滴加完毕后继续搅拌24~28h，搅拌完毕后采用0.2~0.25μm的过滤膜进行过滤，将过滤产物经冷冻干燥制备成聚乳酸纳米微球。
11、作为优化，所述改性聚乳酸纳米微球包括以下制备步骤：将1，3-二（氨基丙基）四甲基二硅氧烷加入至1，3-二（氨基丙基）四甲基二硅氧烷质量10~12倍的二甲基亚砜中，搅拌均匀，制备成1，3-二（氨基丙基）四甲基二硅氧烷溶液备用；将聚乳酸纳米微球加入至聚乳酸纳米微球质量35~40倍的二氯甲烷中，超声分散10~15min，超声分散完毕后，在氮气保护、温度为30~40℃条件下，加入聚乳酸纳米微球质量6~8倍的五氯化磷，搅拌均匀并回流反应1~1.5h，回流反应完毕后通过常压蒸馏除去二氯甲烷，并升温至45~55℃，之后加入聚乳酸纳米微球质量4~5倍的二甲基亚砜，并在1~1.2h内匀速滴加1，3-二（氨基丙基）四甲基二硅氧烷溶液，滴加完毕后反应7~9h，反应完毕后加入聚乳酸纳米微球质量240~250倍的去离子水，搅拌过滤后，将过滤产物用去离子水洗涤2~3次后，冷冻干燥制备成改性聚乳酸纳米微球。
12、一种宿主蛋白残留检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
13、a1、用抗hcp蛋白抗体包被酶标板；
14、a2：向包被后的酶标板中加入待检测样品和标准品溶液，之后进行孵育和洗涤；
15、a3：向s2洗涤后的酶标板中加入生物素标记的抗体，之后进行孵育和洗涤；
16、a4：向s3洗涤后的酶标板中加入链霉亲和素改性纳米颗粒，之后进行孵育和洗涤；
17、a5：向s4洗涤后的酶标板中加入tmb显色液，孵育，再加入终止液终止反应，于450nm波长下测定吸收度值。
18、与现有技术相比，本专利技术所达到的有益效果是：
19、本申请为解决elisa中存在的非特异性吸附问题，从链霉亲和素入手，将传统的通过辣根过氢化物酶标记的链霉亲和素，通过聚乙二醇与改性后的聚乳酸纳米微球进行桥接，使其形成具备可阻止特异性吸附的纳米微球，从而提高其灵敏性；
20、本申请采用聚乳酸纳米微球作为核心，并且在生成聚乳酸纳米微球过程中加入了明胶，最终生成的聚乳酸纳米微球形态均一，并且提高了其生物活性；以聚乳酸纳米微球作为核心，主要是利用聚乳酸本身所具备的良好生物相容性及其可降解性，但是聚乳酸纳米微球作为核心，其内部含有大量的酯基，会导致最终制备出的微球存在疏水性强且生物活性低的性能缺点，并且聚乳酸本身还会导致局部过酸，而其在酸性条件也会加快分解且分解后又会产生大量酸，从而进一步加快其分解速率，因此本申请首先采用五氯化磷将聚乳酸纳米微球表面的羧基进行酰氯化，之后与1，3-二（氨基丙基）四甲基二硅氧烷上的氨基反应生成酰胺键，进而消除其表面的羧基，并且通过接枝1，3-二（氨基丙基）四甲基二硅氧烷改善其疏水性，加强其分散性，并增加其上的改性位点；
21、之后通过聚乙烯醇进行接枝改性，一方面增加其亲水性，另一方面以聚乙烯醇连接链霉亲和素，从而使其上的链霉亲和素具备抗非特异性吸附的能力。
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1.一种宿主蛋白残留检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有抗HCP蛋白抗体的酶标板、生物素标记的抗体、链霉亲和素改性纳米颗粒和辅助制剂；
2.根据权利要求1所述的宿主蛋白残留检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素改性纳米颗粒采用改性聚乳酸纳米微球通过活性酯-聚乙二醇-活性酯桥接链霉亲和素制得。
3.根据权利要求1所述的宿主蛋白残留检测试剂盒，其特征在于，所述辅助制剂包括：pH为9.6的碳酸盐缓冲液、TMB显色液和终止液。
4.根据权利要求1所述的宿主蛋白残留检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为硫酸或盐酸。
5.根据权利要求4所述的宿主蛋白残留检测试剂盒，其特征在于，所述聚乳酸纳米微球包括以下制备步骤：将聚乳酸加入至聚乳酸质量65~70倍的二氯甲烷中，搅拌均匀，制备成聚乳酸溶液备用；将明胶加入至明胶质量330~340倍的去离子水中，搅拌均匀，制备成明胶溶液备用；在温度为25~35℃，转速为1800rmp条件下，于0.8~1h内将聚乳酸溶液滴加入至明胶水溶液中，滴加完毕后继续搅拌24~28h，搅拌完毕后采用0.2~0.25μm的过滤膜进行
6.根据权利要求5所述的宿主蛋白残留检测试剂盒，其特征在于，所述改性聚乳酸纳米微球包括以下制备步骤：将1，3-二（氨基丙基）四甲基二硅氧烷加入至1，3-二（氨基丙基）四甲基二硅氧烷质量10~12倍的二甲基亚砜中，搅拌均匀，制备成1，3-二（氨基丙基）四甲基二硅氧烷溶液备用；将聚乳酸纳米微球加入至聚乳酸纳米微球质量35~40倍的二氯甲烷中，超声分散10~15min，超声分散完毕后，在氮气保护、温度为30~40℃条件下，加入聚乳酸纳米微球质量6~8倍的五氯化磷，搅拌均匀并回流反应1~1.5h，回流反应完毕后通过常压蒸馏除去二氯甲烷，并升温至45~55℃，之后加入聚乳酸纳米微球质量4~5倍的二甲基亚砜，并在1~1.2h内匀速滴加1，3-二（氨基丙基）四甲基二硅氧烷溶液，滴加完毕后反应7~9h，反应完毕后加入聚乳酸纳米微球质量240~250倍的去离子水，搅拌过滤后，将过滤产物用去离子水洗涤2~3次后，冷冻干燥制备成改性聚乳酸纳米微球。
7.一种宿主蛋白残留检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种宿主蛋白残留检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有抗hcp蛋白抗体的酶标板、生物素标记的抗体、链霉亲和素改性纳米颗粒和辅助制剂；
2.根据权利要求1所述的宿主蛋白残留检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素改性纳米颗粒采用改性聚乳酸纳米微球通过活性酯-聚乙二醇-活性酯桥接链霉亲和素制得。
3.根据权利要求1所述的宿主蛋白残留检测试剂盒，其特征在于，所述辅助制剂包括：ph为9.6的碳酸盐缓冲液、tmb显色液和终止液。
4.根据权利要求1所述的宿主蛋白残留检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为硫酸或盐酸。
5.根据权利要求4所述的宿主蛋白残留检测试剂盒，其特征在于，所述聚乳酸纳米微球包括以下制备步骤：将聚乳酸加入至聚乳酸质量65~70倍的二氯甲烷中，搅拌均匀，制备成聚乳酸溶液备用；将明胶加入至明胶质量330~340倍的去离子水中，搅拌均匀，制备成明胶溶液备用；在温度为25~35℃，转速为1800rmp条件下，于0.8~1h内将聚乳酸溶液滴加入至明胶水溶液中，滴加完毕后继续搅拌24~28h，搅拌完毕后采用0.2~0.25μm的过滤...
【专利技术属性】
技术研发人员：李君，余少平，
申请(专利权)人：北京康润诚业生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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