一种提高NK细胞杀伤活性的培养方法技术

技术编号：43001909 阅读：10 留言：0更新日期：2024-10-15 13:29

本发明专利技术属于免疫学领域，公开了一种提高NK细胞杀伤活性的培养方法。其包括如下步骤：（1）分离获得外周血单个核细胞，（2）用包被液对培养瓶进行包被，在含有大米低聚肽、二十二碳六烯酸、IL‑15和IL‑12的培养基进行诱导培养；（3）在含有DMEM培养基、吡嗪甲酰胺、灯盏花素、谷氨酰胺、IL‑2和IL‑21的培养基中扩增培养，得到NK细胞。本发明专利技术中大米低聚肽、二十二碳六烯酸能够协同作用，促进NK细胞的诱导分化，并且能够和扩增培养基中的吡嗪甲酰胺、灯盏花素之间相互配合作用，有效提高NK细胞的体外肿瘤杀伤活性，在肿瘤免疫治疗中具有重要作用。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫学领域，尤其涉及一种提高nk细胞杀伤活性的培养方法。

技术介绍

1、目前，恶性肿瘤一直以来都是人类健康面临的最大威胁，世界范围内的人类一直不断探索更好的肿瘤治疗方法，针对不同的肿瘤类型制定快速有效的治疗方案能够有效控制疾病的死亡率，其中肿瘤的治疗包括了手术治疗、放射治疗、化学治疗和免疫治疗。

2、近年来，肿瘤免疫治疗得到了迅速发展，它指的是利用免疫学原理调节免疫系统，调动体内的抗肿瘤特异性免疫应答，依靠人体内的免疫系统来抑制肿瘤细胞的功能，达到清除肿瘤细胞的目的。虽然随着科学的进步和现代医学技术的提升，有些肿瘤的治愈率在临床上已经得到了一定程度的改善，但整体上肿瘤发病率仍然居高不下。因此，深入研究抗肿瘤免疫系统、提高患者对肿瘤免疫疗法的应答，具有重要社会意义。

3、自然杀伤细胞（nk细胞）是具有一定杀伤能力的免疫效应细胞，是抗肿瘤固有免疫反应中的重要组成部分，可以分泌大量的趋化因子以及细胞因子等，在机体抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节方面发挥着关键作用，与t细胞相比，nk细胞表面具有复杂多样的活化性和抑制性受体，不需要抗原的预先刺激，就能迅速应答，直接快速识别肿瘤细胞。因此，越来越多的研究人员开始把nk细胞作为肿瘤免疫治疗的重点关注内容。

4、细胞增殖数量和细胞杀伤能力的提高是提升细胞治疗效果的主要因素，但在外周血淋巴细胞中，nk细胞的数量较少，仅占5-10%，并且现有的体外培养nk细胞的方法存在诱导效率低，杀伤活性差的问题。因此，有必要品对nk细胞的培养过程进行改进。

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技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种提高nk细胞杀伤活性的培养方法，该方法能够有效提升cd3-cd56+细胞的比例，提高nk细胞的肿瘤细胞杀伤活性。

2、本专利技术的目的采用如下技术方案实现：

3、一种提高nk细胞杀伤活性的培养方法，包括以下步骤：

4、（1）分离获得外周血单个核细胞；

5、（2）采用包被液对培养瓶进行包被，将包被后的培养瓶作为诱导培养瓶，取步骤（1）中外周血单个核细胞用诱导培养基重悬，接种于诱导培养瓶中诱导培养2-3d，得到细胞培养液；

6、所述诱导培养基的成分为：aim-v培养基、大米低聚肽3.5-10μg/ml、二十二碳六烯酸1-5μg/ml、il-15 80-100ng/ml、il-12 200-300iu/ml；

7、（3）向步骤（2）的细胞培养液中加入扩增培养基继续培养8-10d，每2-3天补充一次扩增培养基，使细胞密度保持在1-3×106个/ml，得到nk细胞；

8、所述扩增培养基的组成为：dmem培养基、吡嗪甲酰胺10-20ng/ml、灯盏花素1-5μg/ml、谷氨酰胺5-15μg/ml、il-2 800-1000iu/ml、il-21 90-120iu/ml。

9、进一步地，步骤（2）中，所述大米低聚肽为大米蛋白粉经酶解、过滤后得到。

10、进一步地，步骤（2）中，所述包被液由aim-v培养基和添加在其中的抗cd3抗体组成，抗cd3抗体在包被液中的浓度为0.5-5μg/ml。

11、进一步地，步骤（1）中，所述外周血单个核细胞的具体制备方法为：无菌条件下采集人体外周血，用pbs缓冲液稀释外周血，采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞。

12、进一步地，步骤（2）中，所述外周血单个核细胞的接种密度为1-5×106个/ml。

13、进一步地，所述诱导培养和扩增培养均在37℃，5%co2的条件下进行。

14、相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：

15、1.本专利技术通过研究表明诱导培养基中大米低聚肽、二十二碳六烯酸促进了nk细胞的诱导分化效率，并且能够和扩增培养基中的吡嗪甲酰胺、灯盏花素之间相互配合作用，有效提升nk细胞中cd3-cd56+的比例，从而提高nk细胞的肿瘤细胞杀伤活性。

16、2.本专利技术提供了一种nk细胞杀伤活性的培养方法，该培养方法安全性较高，并且制备得到的nk细胞在肿瘤免疫治疗中具有重要作用。

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【技术保护点】

1.一种提高NK细胞杀伤活性的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述提高NK细胞杀伤活性的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述大米低聚肽为大米蛋白粉经酶解、过滤后得到。

3.根据权利要求1所述提高NK细胞杀伤活性的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述包被液由AIM-V培养基和添加在其中的抗CD3抗体组成，抗CD3抗体在包被液中的浓度为0.5-5μg/mL。

4.根据权利要求1所述提高NK细胞杀伤活性的培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述外周血单个核细胞的具体制备方法为：无菌条件下采集人体外周血，用PBS缓冲液稀释外周血，采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞。

5.根据权利要求1所述提高NK细胞杀伤活性的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述外周血单个核细胞的接种密度为1-5×106个/mL。

6.根据权利要求1所述提高NK细胞杀伤活性的培养方法，其特征在于，所述诱导培养和扩增培养均在37℃，5%CO2的条件下进行。

【技术特征摘要】

1.一种提高nk细胞杀伤活性的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述提高nk细胞杀伤活性的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述大米低聚肽为大米蛋白粉经酶解、过滤后得到。

3.根据权利要求1所述提高nk细胞杀伤活性的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述包被液由aim-v培养基和添加在其中的抗cd3抗体组成，抗cd3抗体在包被液中的浓度为0.5-5μg/ml。

4.根据权利要求1所述提高nk细胞杀伤活性的培...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗秋菊，吴帅，
申请(专利权)人：清泽医疗科技广东有限公司，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人