【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物生物，具体涉及一种林檎与寒富苹果远缘杂交幼胚挽救成苗方法及应用。
技术介绍
1、林檎(malus doumeri)为蔷薇科(rosaceae)苹果属(maluspumila mill.)植物，主要分布于中国广西、福建、云南及越南，海拔700-2400米山地混交林或山谷沟边，高度为4～10米灌木或小乔木，是一种热带野生苹果，叶绿体序列数据表明与栽培苹果亲缘关系较远。苹果(malus×domestica borkh)是世界上最广泛种植的大宗水果之一，果实酸甜多汁、富含膳食纤维、维生素等营养物质，目前富士系、嘎啦系、元帅系等是世界主栽品种，随着全球苹果育种工作的深入发展，遗传资源利用渠道越来越狭窄，果实风味、外观品质、抗性等趋于单一，随着全球气候变暖和市场对品种、品质多样性的需求，常规性育种已很难满足，通过远缘杂交途径育成品质优良、抗逆性强、低需冷量等优点的苹果新种质是一种可能。
2、远缘杂交不亲和及胚早期败育是果树杂交育种存在的主要障碍，苹果与梨远缘杂交报道最早于1952年，以‘丰产’(fertility)梨为母本，以‘crawley beauty’苹果为父本，得到16粒杂交种子；1980年代日本学者以日本梨(pyrus setotina rehd.var.culta rehd)与苹果(malus×domestica borkh)进行杂交，但杂交种子自然条件下在萌芽后6个月内全部死亡(梁春莉，2005；孙亮，2008；赵晓东，2010；杨旭源，2017)。胚挽救是获取远缘杂交幼苗的主要技术手段之一，对早
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种林檎与寒富苹果远缘杂交幼胚挽救成苗方法及应用，建立的林檎与寒富苹果种间胚挽救体系，胚萌发率达74.3％，增殖培养增殖系数达到5.1，生根培养生根率95.5％，幼苗生长健壮，长势良好，炼苗移栽成活率达96.4％。
2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术是通过以下技术方案实现：
3、一种林檎与寒富苹果远缘杂交幼胚挽救成苗方法，包括以下步骤：
4、s1：以寒富苹果为父本，收集花粉冻存后备用；以林檎为母本，次年铃铛花期进行人工去雄授粉；
5、s2：采摘母株杂交后55-60天左右的杂交幼果，消毒后无菌剥取完整种子，接种于胚挽救培养基上。
6、s3：然后转移到温度24±2℃，led白红7：3灯管，光照强度为5000lx，光照时间为12h/d的培养间，培养40d左右，待幼胚萌发新梢后，截取萌发1.5-2.0cm长度的无菌新梢接种于增殖培养基，相同培养条件下培养，每35-40d继代1次，继代次数8次以内。
7、s4：杂种苗增殖培养后，将株高超过2cm以上的健壮丛生苗切取单株，接种于生根基质中，相同培养条件下培养，25-30d可获得生根杂种幼苗，当每株根系生长达到3-4条、6片以上真叶、苗高2.0cm以上，可直接进行移栽。
8、s5：提前准备好营养钵用500倍多菌灵溶液消毒，基质为椰糠：珍珠岩：有机肥7：3：1，阳光暴晒12h以上，移栽后浇透定根水，大棚白天卷起侧面，用8针遮阳网遮盖(约阻隔50％阳光)，湿度保持在50％左右，注意通风透气，2周后可获得林檎与寒富苹果远缘杂交植株。
9、进一步的，所述步骤s1具体包括：以‘寒富苹果’(malus×domestica borkh)为父本，采集头年铃铛花期的自然花，在室温下剥取花药，100瓦白炽灯烤干，待花粉开裂散粉后，收集于1.5ml或2ml离心管中，-80℃冻存，第二年使用；以‘林檎’(malus doumeri)为母本，次年铃铛花期进行人工去雄授粉，授粉后立即套硫酸纸袋，10-14天摘袋。
10、进一步的，所述步骤s2具体包括：取杂交55-60d左右的杂交幼果，洗洁精清洗幼果干净后，超净台内75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，0.1％hgcl2灭菌6-8min，无菌水冲洗4-5次，剥取幼胚，接种于胚挽救培养基上，放置于4℃暗培养15-20d。
11、进一步的，所述培养基的配制具体包括：
12、基础培养基、培养基质：ms培养基，其中琼脂粉5-7g/l，蔗糖20-30g/l，ph＝5.8；1/2ms培养液，椰糠，珍珠岩。
13、培养条件：温度24±2℃，led灯管白红7：3，光照强度为3000lx，光照时间为12小时/天。
14、胚挽救培养：ms+6-ba0.5-1.0mg/l+iaa0.1-0.2mg/l+pva0.1mg/l，培养30-40天。
15、增殖培养基：ms+6-ba0.2-0.5mg/l+naa0.1-0.2mg/l+ga30.1-0.3mg/l+pva0.1-0.3mg/l，萌发的幼胚无菌新梢，截取2.0-2.5cm长度茎段接种与增殖培养基，20天左右继代1次，可继代8次。
16、生根基质培养：8g椰糠+2g珍珠岩+20ml生根培养液(1/2ms+naa0.5-1.0mg/l+iaa1.0-1.5mg/l)，选取生长良好，高度大于4cm的幼苗进行生根培养，培养40天左右，可直接移栽至营养钵，移栽时间为2月中旬。
17、另一方面，本专利技术提出上述方法在苹果远缘杂交育种中的应用。
18、本专利技术的有益效果：
19、远缘杂交育种是指在种间、属间甚至更高分类单元间的杂交，人为定向获得具有优良性状的种质资源，通过杂交可以扩大后代性状分离，丰富遗传多样性，因此远缘杂交技术是扩大遗传基础、增加遗传变异、创制新种质资源的重要途径。远缘杂交就是在克服生殖隔离的基础上进行基因交流，从而形成区别于亲本的杂交子代。虽然异源多倍体在自然界中存在较多，但人为进行远缘杂交具有一定困难，学者推测自然杂交产生的异源多倍体的表观形态、基因结构等不稳定特性可能会因为进化适应(自然选择)进程而消除，从而形成稳定的物种；而人为进行远缘物种杂交，这种过程时间短、变化大，杂交获得可育后代困难，杂种胚与胚乳组织发育不协调，胚乳过早降解，不能为杂种胚提供营养导致发育后期衰败或退化，表现为杂种不育、衰败、不能成活等，极大限制了远缘杂交成功率。
20、胚挽救是远缘杂交后代成活率提升的关键技术之一，由于远缘杂交胚95％以上无法播种成苗，或在发育早期胚败育或退化，选择在幼胚早期、中期进行离体培养，人工培育使杂交胚萌发率提升，进而形成幼苗，未成熟的幼胚，特别是发育早期的幼胚，在离体培养时一般不易成功本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种林檎与寒富苹果远缘杂交幼胚挽救成苗方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的林檎与寒富苹果远缘杂交幼胚挽救成苗方法，其特征在于：所述步骤S1具体包括：以‘寒富苹果’为父本，采集头年铃铛花期的自然花，在室温下剥取花药，100瓦白炽灯烤干，待花粉开裂散粉后，收集于1.5ml或2ml离心管中，-80℃冻存，第二年使用；以‘林檎’为母本，次年铃铛花期进行人工去雄授粉，授粉后立即套硫酸纸袋，10-14天摘袋。
3.如权利要求1所述的林檎与寒富苹果远缘杂交幼胚挽救成苗方法，其特征在于：所述步骤S2具体包括：取杂交55-60d的杂交幼果，洗洁精清洗幼果干净后，超净台内75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，0.1％HgCl2灭菌6-8min，无菌水冲洗4-5次，剥取幼胚，接种于胚挽救培养基上，放置于4℃暗培养15-20d。
4.如权利要求1所述的林檎与寒富苹果远缘杂交幼胚挽救成苗方法，其特征在于：培养基的配制具体包括：
5.如权利要求1-4任一项所述方法在苹果远缘杂交育种中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种林檎与寒富苹果远缘杂交幼胚挽救成苗方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的林檎与寒富苹果远缘杂交幼胚挽救成苗方法，其特征在于：所述步骤s1具体包括：以‘寒富苹果’为父本，采集头年铃铛花期的自然花，在室温下剥取花药，100瓦白炽灯烤干，待花粉开裂散粉后，收集于1.5ml或2ml离心管中，-80℃冻存，第二年使用；以‘林檎’为母本，次年铃铛花期进行人工去雄授粉，授粉后立即套硫酸纸袋，10-14天摘袋。
3.如权利要求1所述的林檎...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄文静，杨光柱，郑丽萍，马钧，李帆，
申请(专利权)人：云南省农业科学院园艺作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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