【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其是指一种ct45基因敲入的小鼠模型及其构建方法与应用。
技术介绍
1、肺癌在临床和组织病理学上可以分为小细胞肺癌(small cell lung cancer，sclc)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，nsclc)及大细胞肺癌三种类型。其中nsclc占肺癌发病人数的85％左右。肺癌发病率在全球所有癌症据首，五年生存率仅18％，其主要原因由于是由于肺癌发病机制迄今尚未阐明，且缺乏早期诊断科学技术，及能够治愈绝大多数肺癌病人的有效药物缺如。因此，研究和阐明肺癌发表机制，研发出新的肺癌诊断标志物和有效抗肺癌药物，成为医学、肿瘤学和药学领域亟需解决的科学技术问题。
2、动物模型是肺癌研究和药物研发的重要工具。虽然现有三类肺癌动物模型，包括化学致肺癌小鼠模型、植瘤小鼠肺癌模型和基因工程肺癌小鼠模型，由于肺癌研究和药物实验，但是这些模型还存在着诸多不足之处，不能满足肺癌研究和控癌药物研发的需要。
3、化学致肺癌小鼠模型使用致癌物质如苯并芘等诱导肺上皮细胞发生恶性转化和癌变，导致肺癌发生。但化学致癌物诱导肺癌时小鼠癌症发生的变异性很大，在小鼠发病时间上难以控制，且重复性差。此外，苯并芘等多种致癌化合物属于严格管控的有毒有害物质，其购买和使用受到严格管控和限制。再者，抽烟和香烟烟雾诱导的肺癌发生模型也有局限性，在技术上需要特制的香烟烟雾小鼠笼位，抽烟和香烟烟雾诱导的肺癌发生所需的时间为一年左右，重复性差，变异性很大。鉴于上述诸多技术和管理上的原因，化学致肺
4、移植瘤小鼠模型利用人肺癌细胞株进行异位或原位移植(cdx)，或采用肺癌病人肿瘤组织进行异位或原位移植(pdx)已完成常用的肺癌小鼠模型。由于人肺癌细胞移植瘤小鼠易操作，得到了较多的应用；而人肺癌pdx模型由于造模技术难度高，实际应用较少。然而，移植瘤小鼠模型须采用免疫缺陷小鼠，例如nod小鼠、scid小鼠，或nod/scid小鼠等；采用免疫系统功能正常的小鼠难以生成移植瘤小鼠。众所周知，体内免疫系统在抗肿瘤和肿瘤免疫治疗中起了举足轻重的作用，因而免疫缺陷小鼠用于肺癌机制研究和药物治疗都具有很大的局限性。此外，人肺癌细胞移植瘤小鼠模型虽然方法简单和成瘤率高，但与临床吻合度低。肺癌原位移植(pdx)模型与临床吻合度高，但操作难度大，易导致小鼠气胸和死亡。
5、基因工程肺癌小鼠模型采用基因编辑技术改变基因组dna，生成基因敲入或基因敲多小鼠基因进行定向设计，在小鼠体内产生癌基因或是抑瘤基因缺失，从而生成自发性肺癌小鼠模型，基因工程肺癌小鼠模式动物受到了人们的日益重视，及得到越来越多的应用。常用的基因突变肺癌小鼠模型包括kras突变、egfr突变、alk基因重排、braf突变、pik3ca突变等，这些自发性肺癌动物模型都采用免疫正常小鼠建模，能够很好地模拟临床肺癌患者的整个发病过程，同时也有助于模拟肿瘤发生过程中肿瘤微环境的形成，能够追踪体内肺癌起始和演进的各个阶段和确定肿瘤进展分期，其应用日益增多。但现有基因工程肺癌小鼠模型也同样存在一定的局限性，由于致瘤基因突变率在人肺癌的发生率较低，例如kras突变为15-25％，egfr突变为10-50％、alk基因重排为3-7％、braf突变仅1-3％、pik3ca突变仅1-3％。这就导致了单个突变基因的肺癌动物模型并不能很好的代表大多数人肺癌患者的发病机制和演进规律。此外，实践证明上述单个基因突变小鼠需要很长时间，往往需要一年以上才能发生肺癌。实际上，上述突变基因需在p53基因缺失共同存在时小鼠易发肺癌。因此，需要采用肿瘤特异性和敏感性都高的致瘤基因，来建立能够模拟大多数肺癌患者肿瘤发生和演进过程的通用性高的肺癌小鼠模型。如何建立这样的小鼠模型已成为亟需解决的科学和技术问题。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种ct45基因敲入的小鼠模型及其构建方法与应用。本专利技术构建ct45基因敲入载体并将其注射入小鼠体内，得到f0小鼠；将f0小鼠与cre-loxp小鼠杂交，得到ct45基因表达小鼠；最后将ct45基因表达小鼠与sftpc-cre小鼠杂交，得到在肺部特异性表达ct45基因的基因敲入小鼠，成功构建了一种新的肺癌小鼠模型。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种ct45基因敲入的小鼠模型，将ct45基因敲入小鼠基因组的rosa26位点。
3、进一步地，所述ct45基因在小鼠肺泡ii型上皮细胞中特异性表达。
4、专利技术人前期研究了284例肺癌患者样本，发现其中187例呈ct45阳性表达，其阳性率高达65.8％，而且在各种肺癌亚型都呈高表达，其中ct45在腺癌中的阳性率为61.6％，在鳞癌中的阳性率为75.7％，在小细胞肺癌中的阳性率为48.1％，但在正常肺和肺炎组织都不表达，具有高肺癌特异性和敏感性，且ct45的异常高表达与肺癌病人预后差密切相关。因此选择ct45基因用于构建肺癌小鼠模型。
5、进一步地，ct45基因在肺泡ii型上皮细胞中特异性表达通过肺泡表面活性蛋白c(sftpc)启动子实现。
6、本专利技术的第二个目的是提供用于构建ct45基因敲入小鼠的基因敲入载体，所述基因敲入载体包括人源ct45编码cdna片段hct4cds和调控元件loxp-stop-loxp。
7、进一步地，所述基因敲入载体还包括wpre元件。
8、进一步地，所述人源ct45编码cdna片段hct4cds的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9、进一步地，loxp-stop-loxp片段是为了实现ct45基因的条件性敲入。该表达元件敲入小鼠基因组后，在小鼠体内需要通过cre重组酶切除stop片段后才能实现目的基因的稳定表达。
10、本专利技术的第三个目的是提供一种ct45基因敲入的小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
11、步骤s1、构建基因敲入载体，注射入小鼠，得到f0小鼠；
12、步骤s2、将f0小鼠与cre-loxp小鼠杂交，得到ct45基因表达的ct45+/+cre+/+小鼠；
13、步骤s3、将ct45+/+cre+/+小鼠与sftpc-cre小鼠杂交，将获得的杂合子小鼠进行自交，得到肺特异性表达的ct45基因敲入小鼠。
14、进一步地，包括对基因敲入小鼠的基因型鉴定。
15、进一步地，用于基因型鉴定的引物核苷酸序列如seq id no.2-3所示。
16、具体地，正向引物为5’-agtcgctctgagttgttatcag-3’；
17、具体地，反向引物为5’-agtccctattggcgttactatgg-3’。
18、进一步地，使用ct45基因敲入小鼠尾部的基因组dna进行基因型鉴定。
19、本专利技术的第四个目的是提供上述小鼠模型、上述基因敲入载体或上述构建方法在ct45基因表达研究中的应用。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种CT45基因敲入的小鼠模型，其特征在于：将CT45基因敲入小鼠基因组的ROSA26位点。
2.根据权利要求1所述的小鼠模型，其特征在于：所述CT45基因在小鼠肺泡II型上皮细胞中特异性表达。
3.用于构建CT45基因敲入小鼠的基因敲入载体，其特征在于：所述基因敲入载体包括人源CT45编码cDNA片段hCT4CDS和调控元件LOXP-STOP-LOXP。
4.根据权利要求3所述的基因敲入载体，其特征在于：所述基因敲入载体还包括WPRE元件。
5.一种CT45基因敲入的小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：包括对基因敲入小鼠的基因型鉴定。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：用于基因型鉴定的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示。
8.权利要求1-2任一所述的小鼠模型、权利要求3-4任一所述的基因敲入载体或权利要求5-7任一所述的构建方法在CT45基因表达研究中的应用。
9.权利要求1-2任一所述的小鼠模型、
10.权利要求1-2任一所述的小鼠模型、权利要求3-4任一所述的基因敲入载体或权利要求5-7任一所述的构建方法在制备肺癌辅助诊断产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种ct45基因敲入的小鼠模型，其特征在于：将ct45基因敲入小鼠基因组的rosa26位点。
2.根据权利要求1所述的小鼠模型，其特征在于：所述ct45基因在小鼠肺泡ii型上皮细胞中特异性表达。
3.用于构建ct45基因敲入小鼠的基因敲入载体，其特征在于：所述基因敲入载体包括人源ct45编码cdna片段hct4cds和调控元件loxp-stop-loxp。
4.根据权利要求3所述的基因敲入载体，其特征在于：所述基因敲入载体还包括wpre元件。
5.一种ct45基因敲入的小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：...
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