【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及循环游离dna检测炼狱，具体涉及一种脂质体、cfdna提取处理液及其制备方法和应用。
技术介绍
1、循环游离dna(circulating free dna，cfdna)是在外周血中发现的游离于细胞外的dna，是核小体凋亡dna在细胞内循环核酸酶的作用下天然断裂形成的平均长度为180～200bp的小片段。cfdna释放到血液循环中的机制目前主要有两种：第一种是通过凋亡或坏死的细胞死亡被动释放dna。在正常的生理状态下，由于有吞噬细胞能够对凋亡和坏死的细胞碎片进行清除，因此健康个体血浆中cfdna含量较低。而在某些特定情况下，如癌症患者中，这些清除机制不能有效的发挥作用，导致包括dna在内的细胞碎片积累，随后被一同释放到血液中。cfdna释放的第二种机制是通过主动分泌，cfdna的分泌是通过释放细胞外小泡来进行的。人体cfdna的含量受肥胖、运动及肿瘤等多种因素影响。有研究表明cfdna广泛存在于人体血液、尿液、脑脊液、胸腹水、卵泡液、唾液等各类体液中。在健康人外周血中cfdna含量均值约为30ng/ml，几乎都来自凋亡或坏死细胞，肿瘤患者体内的cfdna则更多来源于肿瘤细胞及邻近非肿瘤细胞的凋亡。
2、目前cfdna的检测主要有pcr和ngs两种方法，近年来基于这两种方法衍生出许多更加高效灵敏的检测方法。随着检测灵敏度和精确度的不断提高，pcr技术现已发展为实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，qpcr)、数字pcr(digital pcr，dpcr)和微滴式数字pc
3、cfdna提取效率是决定检测结果的重要步骤，但cfdna含量低且片段小，如何高效快捷提取cfdna一直是研究的重点。目前提取cfdna主要方法有异戊醇抽提法、磁珠法和亲和柱法等，大多实验室均采用商业试剂盒来提取cfdna。cfdna主要存在于血液中，相比于血清而言，血浆是获得cfdna更为理想的生物样本，但其在血液中的总百分比极低且片段小，使得现有市售的cfdna提取试剂盒提取后的核酸浓度太低，很难满足下游检测需要。
4、公开号为cn111139234b的中国专利公开了一种游离dna提取试剂盒，用于提取血浆中游离dna，包含脂质体磁珠溶液、洗涤液i、洗涤液ii、洗脱液以及磁分离架。脂质体磁珠溶液含有脂质体磁珠，该脂质体磁珠用于吸附血浆内游离dna并使得dna被分离。该专利技术利用脂质体对磁珠进行处理，增强磁珠特异性性能，有利于吸附血浆内游离dna，但是该专利的游离dna提取效率仍有待提高。因此，需要提供一种提取方法，可以快速高效处理血液样本，获得高浓度核酸，以满足下游检测的需要。
技术实现思路
1、本专利技术旨在提供一种脂质体及其制备方法，用于制备cfdna提取处理液，提高游离dna的提取效率。
2、本专利技术还提供了一种cfdna提取处理液及其制备方法，cfdna的提取效率高。
3、本专利技术还提供了一种cfdna提取处理液在cfdna提取试剂盒中的应用，提高游离dna的提取效率。
4、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
5、一种脂质体，由5～30mm胆固醇和100～600mm磷脂组成；所述磷脂为1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-琥珀酰、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-琥珀酰的钠盐、1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油、1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油的钠盐、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱中的一种或多种。
6、其中，胆固醇可以改善脂质链和双分子层形成的结构，调节膜的流动性和刚性。1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(琥珀酰)(钠盐)(spe)、1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油(钠盐)(dspg)和1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(dspc)是制备脂质体重要的磷脂，具有较好的稳定性，且杂质含量低。脂质体有较好的柔顺性和亲水性，可与cfdna竞争被单核-巨噬细胞系统吞噬，从而抑制体外巨噬细胞对cfdna的清除。
7、优选地，1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(琥珀酰)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(琥珀酰)的钠盐的浓度为35～200mm，1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油和1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油的钠盐的浓度为35～200mm，1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱的浓度为35～200mm。进一步优选地，1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(琥珀酰)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(琥珀酰)的钠盐的浓度为150～200mm，1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油和1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油的钠盐的浓度为150～200mm，1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱的浓度为150～200mm。
8、根据本专利技术的实施例，还可以对本专利技术作进一步的优化，以下为优化后形成的技术方案：
9、一种脂质体的制备方法，包括以下步骤：
10、将胆固醇、磷脂溶于溶剂，混合反应后，再蒸发溶剂形成脂质膜；
11、脂质膜溶于水或水溶液后，挤压后制得脂质体。
12、在其中一个优选的实施例中，形成脂质膜的步骤具体为将5～30mm胆固醇溶于氯仿中，加入100～200mm 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(琥珀酰)(钠盐)(spe)、100～200mm 1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油(钠盐)(dspg)、100～200mm 1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(dspc)中的一种或多种，再与体积比为1:1的甲醇混合，形成混合溶液。
13、形成脂质膜的步骤中将混合溶液在氮气流下蒸发形成薄的干燥脂质膜，真空去除其附着的有机溶剂。
14、在其中一个优选的实施例中，形成脂质体的步骤中脂质膜在55-65℃下溶于无菌dpbs，水合。
15、在其中一个优选的实施例中，形成脂质体的步骤中挤压后制得脂质体的过程为在55-65℃下用挤压机、聚碳酸酯膜挤压15-25次，得到所需脂质体。具体地，使用avantipolar lipids公司生产的800-1200μl迷你挤压机将merck公司生产的0.3-0.5μm聚碳酸酯膜挤压15-25次，得到所需脂质体。
16、本专利技术还公开了一种cfdna提取处理液，包括脂质体，还包括50～75mm tris-hcl、5～25m本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种脂质体，其特征在于，由5～30mM胆固醇和100～600mM磷脂组成；所述磷脂为1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-琥珀酰、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-琥珀酰的钠盐、1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油、1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油的钠盐、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱中的一种或多种。
2.一种脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.一种cfDNA提取处理液，其特征在于，包括权利要求1中的脂质体，还包括50～75mMTris-HCl、5～25mM EDTA、10～20mM DTAP、0.05～0.1％ProClin 300；优选地，所述cfDNA提取处理液还包括50～60mM Tris-HCl、10～15mM EDTA、15～20mM DTAP、0.05～0.08％ProClin 300。
4.一种权利要求3所述的cfDNA提取处理液在cfDNA提取试剂盒中的应用，其特征在于，在抗凝全血样本中加入权利要求3中的cfDNA提取处理液，培养、分离得到血浆后，再检测cfDNA。
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