【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物免疫检测，具体涉及一种模板化配位驱动组装型类石榴结构免疫磁珠及其制备方法和应用。
技术介绍
1、化学发光(chemiluminescence，cl)是免疫反应中最重要最准确的一种平台。它指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。传统板式化学发光，将待测样本和酶标抗体或抗原，同固相载体上修饰的抗原或抗体共同孵育，结束后洗涤得到抗原抗体复合物，之后将酶底物加入其中，酶特异性催化底物发光，此方法的缺点：由于固液两相存在界面，抗体因受空间位阻效应，抗原抗体结合缓慢，故而需要较长时间孵育才能保证足够量的抗原抗体得以固化，其灵敏度偏低，还会产生非特异性吸附。
2、与传统板式化学发光相比，磁微粒化学发光是将固相捕获基底移植到胶体尺寸磁颗粒表面进行以实现准均相免疫反应同时又可以磁分离富集，大大提高了免疫反应灵敏度和自动化程度。它解决了传统管式/板式固-液界面化学发光方法在反应动力学方面严重受限的技术瓶颈，是一类新型的均相/准均相免疫反应体系。而磁颗粒（即生物磁珠）是其中的关键原材料，对于整体检测试剂的性能提升至关重要。纳米尺寸的磁颗粒由于其晶体结构的特殊性而易表现出超顺磁性，即在外磁场下呈现出较强的磁性。由于大颗粒磁珠只具备顺磁性和铁磁性，因此以尺寸小于20 nm超顺磁临界尺寸基元进行可控组装是构筑磁珠免疫载体的唯一途径。才能同时保有外加磁场作用/撤除条件下的磁分离-重悬特性，以及高磁化率与高饱和磁化强度。目前thermo fisher磁珠发展趋势是从10 μm-6 μm-3 μm，现在thermo fisher 的
3、目前已报道的基元自组装方法包括无模板溶剂挥发诱导自组装方法、实心模板化组装、多孔聚合物微球模板化组装等。其中有机溶剂挥发诱导是经典的自组装方法，优点是水包油体系中的低沸点溶剂易于去除，产物在极性溶剂中具有较好的相稳定性，缺点是产物的颗粒尺寸均一性非常差，孔隙率调节机理不明，难以制备特定的二级结构例如中空或多孔结构，性能有待提升。与之相比，实心模板化组装可以提供优良的尺寸及均一度的控制，但目前在于采用球形二氧化硅等无孔模板，仅实现了表面一层负载。韩国高丽大学的cho等人以实心二氧化硅球为组装模板，通过交替沉积一层表面活性剂-量子点（bmpa-qds）或氨基功能化的表面活性剂-磁颗粒（bmpa-fe3o4）溶液。pang等人利用了交联聚苯乙烯微球（ps）的溶胀-收缩特性，进行磁颗粒或量子点的负载，以获得磁信号和荧光强度，构建了一种具有高灵敏度和特异性的检测沙门氏菌的检测平台。但是，以上通过原位合成法组装磁性纳米颗粒的过程也存在一些缺点，比如难以控制所得磁性纳米颗粒的大小和形状，尤其是需要特定的稳定剂来控制颗粒生长过程的几何形状、表面和内部特性（例如电荷密度、悬空基团种类和孔隙率）方面的演变，生长与负载密度不可控、不可多层组装、表面为多元醇钝化无法进一步化学与生物功能化修饰，更致命的缺点是，模板为实心，仅能近表面单层氧化铁颗粒负载，磁响应十分受限。如果将上述模板换成中心放射状孔道，如树状硅模板并发展配位驱动的内部空间三维填充有望实现小尺寸，高密度，高磁响应的性能。
4、根据软硬酸碱（hsab）理论，硬酸倾向于与硬碱形成稳定的配合物。四氧化三铁其结构中的铁原子以不同的氧化态存在（fe2+和fe3+），并与氧原子形成复杂的氧化物结构，在软硬酸碱（hsab）理论中被作为硬酸，邻苯二酚分子中的两个羟基（-oh）作为配体，提供孤对电子。这两个官能团都可以作为路易斯碱，并在软硬酸碱（hsab）理论中作为硬碱。据hsab理论，硬配体更倾向于与硬酸反应形成稳定的配合物。这些孤对电子可以与金属离子的空轨道形成配位键。fe3+离子具有空的d轨道，能够接受来自邻苯二酚分子的孤对电子，形成配位键。铁离子的电荷和电子结构使其能够与多个邻苯二酚分子配位，形成多核配合物。多巴胺作为双齿配体，可以与铁离子形成多个配位键，增强配合物的稳定性，这种螯合效应提高了配合物的热稳定性和化学稳定性。目前几种单一多巴胺修饰的配体，如多巴胺-聚乙二醇羧胺/胺和两性多巴胺磺酸盐。然而，这种单齿配体与纳米颗粒(np)表面的结合亲和力很弱，容易被生物分子取代，导致纳米颗粒稳定性下降。
5、基于以上技术问题，本申请将多巴胺接枝在硅表面用于铁的有机相亲和组装构建一种亲和力，同时邻苯二酚作为改性基团进行聚合物的改性，得到邻苯二酚接枝的来构筑层层砖瓦结构，对于构建这种亲和力有机相多孔模板多层组装具有重要的意义。
6、目前的层层组装都是基于水相体系中间静电相互作用的层层组装，带相同电荷的组装基元，受到水相体系静电排斥的作用，其组装密度受到影响。而在有机相中通过构建高强度的铁原子-配基亲和作用，进行磁颗粒的致密层层堆积的方法未见报道。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述技术问题，本申请的目的在于提供一种模板化配位驱动组装型类石榴结构免疫磁珠及其制备方法和应用。本专利技术提出以树枝状介孔二氧化硅（dsi）为模板，合成了一种与铁原子高度亲和的邻苯二酚改性硅烷试剂，并通过硅烷化改性，接枝到树状硅模板孔道内部形成高亲和性表面，提供了用于第一层磁颗粒致密组装的结合位点，进而提升整个三维空间的功能基元密度。而第2~5层磁颗粒的组装则由多巴胺接枝的pima介导的有机相逐层亲和组装实现，通过形成砖瓦结构提高结合密度与强度。获得在三维空间内部多层填充（快速磁响应），同时具备小尺寸（优异免疫反应动力学）的类石榴籽结构高性能生物磁珠。
2、本专利技术首先合成了一个大孔树枝状二氧化硅（dsi）纳米模板，通过将乙酰丙酮铁和十二烷二醇添加到苯甲醚溶剂中，以及油酸和油胺作为有机配体，合成和纯化油相磁颗粒。之后合成一个多巴胺改性硅烷试剂并通过多巴胺改性硅烷试剂（末端为邻苯二酚基团的硅烷）表面亲和修饰作为负载油相磁颗粒的模板，进行一层组装，这一层提供了很多的结合位点，其密度决定了整个三维空间的基本密度，接着合成了pda聚合物作为中间层或pei作为中间层，磁颗粒与pda聚合物或pei在油相中通过有机相逐层亲和组装到二氧化硅模板上，并通过烷基硅烷（辛基三甲氧基硅烷，otms）转移到水相中得到水相分散的磁颗粒-二氧化硅亲水组装体并保持高负载密度，再通过过夜沉积致密二氧化硅保护层以stöber方法生长10 nm左右厚度的二氧化硅层保护组装体同时以此为基础进行羧基化得到羧基化的磁珠。最后将该方法得到的羧基化的磁珠用于商用化化学发光检测平台，分别用夹心法和竞争法检测了泌乳素和睾酮，证明了该磁珠在生物检测领域富集分离的能力与普适性。
3本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种模板化配位驱动组装型类石榴结构免疫磁珠的制备方法，其特征在于以树枝状介孔二氧化硅dSi为模板，之后将末端为邻苯二酚基团的亲和性多巴胺改性硅烷试剂接枝到dSi模板孔道内部形成高亲和性表面，提供用于第一层磁颗粒致密组装的结合位点，得到邻苯二酚基团修饰改性的树枝状硅模板，然后在该模板上进行油相磁颗粒IOs的第一层负载组装，之后利用多巴胺接枝的聚合物PDA或PEI作为介导，使聚合物PDA或PEI与油相磁颗粒IOs在有机溶剂中逐层亲和组装到硅模板上，实现油相磁颗粒IOs的层层组装，使在硅模板上组装多层IOs，之后利用正辛基三甲氧基硅烷OTMS在微球组装体表面发生水解缩合反应，实现微球组装体从有机相到水相的相转移，接着通过Stöber法利用正硅酸乙酯TEOS水解生长二氧化硅薄层以提高微球组装体的稳定性，接着，依次通过3-氨丙基三乙氧基硅烷进行氨基修饰、以及通过丁二酸酐进行羧基修饰，得到羧基化的磁珠。
2.如权利要求1所述的一种模板化配位驱动组装型类石榴结构免疫磁珠的制备方法，其特征在于所述末端为邻苯二酚基团的亲和性多巴胺改性硅烷试剂的制备方法包括以下步骤：将多巴胺和二氢-
3.如权利要求1所述的一种模板化配位驱动组装型类石榴结构免疫磁珠的制备方法，其特征在于将亲和性多巴胺改性硅烷试剂接枝到dSi模板上的制备方法包括以下步骤：将dSi模板和亲和性多巴胺改性硅烷试剂加入到乙醇中，并加入氨水调节溶液为碱性，所得混合物应在室温下搅拌反应10-15h，其中亲和性多巴胺改性硅烷试剂中的邻苯二酚基团成分的物质的量与dSi模板的质量之比为0.01-0.03:1，物质的量单位是mmol，质量单位是mg。
4.如权利要求1所述的一种模板化配位驱动组装型类石榴结构免疫磁珠的制备方法，其特征在于所述多巴胺接枝的聚合物PDA的制备方法包括以下步骤：
5.如权利要求1所述的一种模板化配位驱动组装型类石榴结构免疫磁珠的制备方法，其特征在于在邻苯二酚基团修饰改性的树枝状硅模板上进行油相磁颗粒IOs的第一层负载组装，其过程如下：取油相磁颗粒IOs的甲苯溶液，加入邻苯二酚基团修饰改性的树枝状硅模板，超声3-10min得到均一的混合液，随后离心收集沉淀产物，待沉淀中残余的甲苯溶剂挥发后，即得组装一层IOs的组装体dSi/IO1；模板与油相磁颗粒IOs的质量之比为1：1.5-2.0。
6.如权利要求1所述的一种模板化配位驱动组装型类石榴结构免疫磁珠的制备方法，其特征在于所述在硅模板上进行IOs的层层组装多层时，每一层IOs的组装操作均包括以下两个步骤：
7.如权利要求1-6任一所述方法制备的一种模板化配位驱动组装型类石榴结构免疫磁珠。
8.如权利要求7所述的一种模板化配位驱动组装型类石榴结构免疫磁珠在化学发光检测平台中的应用，其特征在于包括磁珠捕获探针iSIS组装过程，磁珠捕获探针iSIS包括泌乳素免疫捕获探针或睾酮免疫捕获探针；
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于包括通过夹心免疫测定法检测泌乳素，过程如下：
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于包括通过竞争法检测睾酮，过程如下：
...【技术特征摘要】
1.一种模板化配位驱动组装型类石榴结构免疫磁珠的制备方法，其特征在于以树枝状介孔二氧化硅dsi为模板，之后将末端为邻苯二酚基团的亲和性多巴胺改性硅烷试剂接枝到dsi模板孔道内部形成高亲和性表面，提供用于第一层磁颗粒致密组装的结合位点，得到邻苯二酚基团修饰改性的树枝状硅模板，然后在该模板上进行油相磁颗粒ios的第一层负载组装，之后利用多巴胺接枝的聚合物pda或pei作为介导，使聚合物pda或pei与油相磁颗粒ios在有机溶剂中逐层亲和组装到硅模板上，实现油相磁颗粒ios的层层组装，使在硅模板上组装多层ios，之后利用正辛基三甲氧基硅烷otms在微球组装体表面发生水解缩合反应，实现微球组装体从有机相到水相的相转移，接着通过stöber法利用正硅酸乙酯teos水解生长二氧化硅薄层以提高微球组装体的稳定性，接着，依次通过3-氨丙基三乙氧基硅烷进行氨基修饰、以及通过丁二酸酐进行羧基修饰，得到羧基化的磁珠。
2.如权利要求1所述的一种模板化配位驱动组装型类石榴结构免疫磁珠的制备方法，其特征在于所述末端为邻苯二酚基团的亲和性多巴胺改性硅烷试剂的制备方法包括以下步骤：将多巴胺和二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮加入到无水dmf中，超声均匀，室温下于100-250 rpm转速下搅拌15-20 h，即得到所述的多巴胺改性硅烷试剂；其中，多巴胺和二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮的摩尔比是1.5-3:1。
3.如权利要求1所述的一种模板化配位驱动组装型类石榴结构免疫磁珠的制备方法，其特征在于将亲和性多巴胺改性硅烷试剂接枝到dsi模板上的制备方法包括以下步骤：将dsi模板和亲和性多巴胺改性硅烷试剂加入到乙醇中，并加...
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