【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物纳米材料，具体涉及一种高效、低毒、稳定的金属离子组装的crispr/cas9递送系统的制备方法和应用。
技术介绍
1、crispr/cas9基因编辑系统是一种功能强大的基因编辑工具，已广泛应用于基础研究、公共卫生、生物医学和农业，涉及多个物种，是非常有希望为人类健康和生活带来革命性改变的技术。然而，如何高效、安全、快速地将crispr系统递送到靶细胞仍然是一个挑战。在临床应用中，人们更希望直接递送crispr/cas9-ribonucleoprotein(rnp)，以确保相对低的脱靶效应和免疫原性。然而，目前许多递送策略普遍面临稳定性差、粒径大、rnp载药量低、制备费力以及潜在的免疫原性等问题，这些问题极大地限制了它们的应用。因此，高效、安全的rnp递送方法是crispr系统基因编辑治疗临床转化过程中的关键问题之一。
2、纳米材料稳定性高、安全、成本低以及可设计性强等优点，使得在药物递送载体方向具有巨大的潜力，可以作为递送crispr系统的工具。脂质体纳米颗粒可以实现递送rnp，但它们易被困在核内体中，这限制了它们的递送效率，阻碍了其临床转化。现有的方法不能满足crispr rnp系统高效、稳定、低毒递送的需求，更精巧设计的递送方法显得意义重大。
3、含铁蛋白材料在生物医学中的研究受到很多关注。大多数含铁蛋白由多肽链通过各种超分子相互作用与铁配位，从而改变蛋白性质和稳定性，具有更好的生物相容性和更高的细胞内化效率。然而，作为载体，因其自身蛋白物化性质(尺寸、电荷等)，应用受限。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的不足，本申请提供了一种铁纳米化组装crispr/cas9-rnp递送系统及其制备方法和应用，以改善现有技术中脂基载体易被困于在核内体产生的递送效率低问题以及rnp稳定性差问题，开发出高效、稳定、低毒、适应性高的crispr/cas9-rnp递送系统。
2、为达到以上目的，本申请采用如下技术方案：
3、项1.一种cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述递送系统包括：
4、cas蛋白rnp复合物，以及
5、与所述cas蛋白rnp复合物连接的金属离子，
6、其中所述cas蛋白rnp复合物包括cas蛋白和sgrna。
7、项2.根据项1所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述金属离子通过共价键与所述cas蛋白rnp复合物连接，优选所述金属离子与所述cas蛋白rnp复合物表面的氨基或羧基形成配位键。
8、项3.根据项1所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述金属离子选自二价铁离子、三价铁离子、二价铜离子。
9、项4.根据项1所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述cas蛋白选自cas9、cas12、cas13、cas14中的一种或两种以上。
10、项5.根据项1-4中任一项所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述cas蛋白与所述金属离子的摩尔比为1:500～2000，优选为1:1000。
11、项6.根据项1-4中任一项所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，在红外吸收光谱中，所述递送系统相对于所述cas蛋白rnp复合物，特征峰红移，优选所述递送系统相对于所述cas蛋白rnp复合物的波数减少46±3cm。
12、项7.根据项1-4中任一项所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述cas蛋白-rnp递送系统的粒径d50为200-1000nm，优选为450nm。
13、项8.根据项1-4中任一项所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述cas蛋白-rnp递送系统的zeta电位为0--20mv，优选为-10mv。
14、项9.根据项1-4中任一项所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述递送系统进一步被脂质体所修饰。
15、项10.根据项1-4中任一项所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述cas蛋白rnp复合物的负载率为40％-70％，优选67.58％。
16、项11.根据项1-4中任一项所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述cas蛋白融合有核定位信号肽
17、项12.根据项1-4中任一项所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述cas蛋白为cas9蛋白。
18、项13.根据项1-4中任一项所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述sgrna如seqid no:1-5所示的核苷酸序列。
19、项14.根据项1-4中任一项所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述cas9蛋白如seq id no:6所示的氨基酸序列。
20、项15.根据项1-4中任一项所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述核定位信号肽如seq id no:7所示的氨基酸序列。
21、项16.一种项1-14中任一项所述的cas蛋白-rnp递送系统的制备方法，包括如下步骤：
22、将sgrna和cas蛋白进行混合制备cas蛋白rnp复合物；
23、将金属离子加入cas蛋白rnp复合物中，静置、离心以获得cas蛋白-rnp递送系统。
24、项17.根据项16所述的方法，还包括进一步利用脂质体对cas-rnp递送系统进行修饰的步骤。
25、项18.根据项16所述的方法，其中，将金属离子加入cas蛋白rnp复合物是通过将金属盐溶液预稀释到缓冲液中，然后将稀释后得到的溶液加入到cas蛋白rnp复合物中来完成的，
26、优选所述缓冲液为弱碱性的缓冲液，
27、进一步优选缓冲液的ph为7.5～8.8。
28、项19.根据项18所述的方法，其中，所述缓冲液选自tris-hcl(ph7.5～8.8)、pbs(ph7.5～8.8)、bis-tris(ph7.5～8.8)。
29、项20.根据项16所述的方法，其中，所述金属离子选自二价铁离子、三价铁离子、二价铜离子)。
30、项21.根据项18所述的方法，其中，所述金属盐选自氯化铁、氯化亚铁、硫酸铁、硝酸铁、氯化铜中的一种或两种以上，优选金属盐为氯化铁。
31、项22.根据项16所述的方法，其中，所述金属离子的浓度为5～50mm，优选为10mm。
32、项23.根据项16所述的方法，其中，所述静置的时间为10～60min，优选20～30min。
33、项24.根据项16所述的方法，其中，所述离心速度为4000～10000rpm，优选8000～9000rpm。
34、项25.根据项16-24中任一项所述的方法，其中，所述脂质体选自lipofectamine2000、lipofectamine rnaimax、lipofectamine cris本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Cas蛋白-RNP递送系统，其中，所述递送系统包括：
2.根据权利要求1所述的Cas蛋白-RNP递送系统，其中，所述金属离子通过共价键与所述Cas蛋白RNP复合物连接，优选所述金属离子与所述Cas蛋白RNP复合物表面的氨基或羧基形成配位键。
3.根据权利要求1所述的Cas蛋白-RNP递送系统，其中，所述金属离子选自二价铁离子、三价铁离子、二价铜离子。
4.根据权利要求1所述的Cas蛋白-RNP递送系统，其中，所述Cas蛋白选自Cas9、Cas12、Cas13、Cas14中的一种或两种以上。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的Cas蛋白-RNP递送系统，其中，所述Cas蛋白与所述金属离子的摩尔比为1:500～2000，优选为1:1000。
6.一种权利要求1-5中任一项所述的Cas蛋白-RNP递送系统的制备方法，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，还包括进一步利用脂质体对Cas-RNP递送系统进行修饰的步骤。
8.一种权利要求1-5中任一项所述的Cas蛋白-RNP递送系统或权利要
9.一种权利要求1-5中任一项所述的Cas蛋白-RNP递送系统或权利要求6-7中任一项所述的方法制备的Cas蛋白-RNP递送系统在肿瘤治疗中的应用。
10.一种权利要求1-5中任一项所述的Cas蛋白-RNP递送系统或权利要求5-6中任一项所述的方法制备的Cas蛋白-RNP递送系统在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述递送系统包括：
2.根据权利要求1所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述金属离子通过共价键与所述cas蛋白rnp复合物连接，优选所述金属离子与所述cas蛋白rnp复合物表面的氨基或羧基形成配位键。
3.根据权利要求1所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述金属离子选自二价铁离子、三价铁离子、二价铜离子。
4.根据权利要求1所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述cas蛋白选自cas9、cas12、cas13、cas14中的一种或两种以上。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的cas蛋白-rnp递送系统，其中，所述cas蛋白与所述金属离子的摩尔比为1:500～2000，优选为1:1000。
【专利技术属性】
技术研发人员：高利增，仇玲玲，孙敏敏，蒋静，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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