【技术实现步骤摘要】
本专利技术具体涉及梨杂交，具体是一种梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法。
技术介绍
1、梨属于蔷薇科植物，是我国落叶果树之一。普遍认为梨属植物的原种起源于我国西部和西南部的山区，其起源可追溯到第三纪。经自然演化，梨果被分为东方梨与西方梨两大分支。东方梨果实一般为嫩脆多汁、甘甜可口的脆肉型梨，另一类则是味浓香甜、软化绵密的软肉型梨。梨果富含多种营养成分，如维生素、果糖酸、果胶和多种矿物质，被誉为“百果之宗”，并具有养血生津、清心润肺的功效，有着很高的经济价值和保健作用，深受消费者喜爱。
2、梨属种间通常不存在生殖隔离，且多数为自交不亲和，从而使得种内与种间杂交常常具有许多复杂的情况，这经常导致杂交后代缺乏差异显著的形态学区分性状，特别是许多重要的农艺性状，如数量性状、多基因控制的质量性状以及表型难以准确鉴定的假质量性状等，传统的形态学标记在植物育种中的表现往往十分有限。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，包括以下步骤：
4、s101、基因组dna提取；
5、s102、ssr分子标记的pcr扩增与电泳检测；
6、s103、ssr纯度鉴定结果统计：
7、根据pcr产物的电泳带型，统计非杂交种谱带的个体数量，计算杂交种纯度，杂交种纯度的计算公式为：p>
8、
9、式中：v表示鉴定纯度，n表示检测总数，m表示非杂交种谱带的个体数量。
10、作为本专利技术进一步的方案：基因组dna提取的方法为：选取目标品种的梨果实，将梨果实放在温度为25℃的环境中堆放5天，然后从梨果实中取出种子，温水浸种6h，置于恒温培养箱中28℃催芽，待根长2—3cm后采取根，提取根中的dna。
11、作为本专利技术再进一步的方案：提取根中dna的方法，包括以下步骤：
12、s201、将根尖置于1.5ml离心管中，迅速研磨成匀浆，加入400mlctab提取液，65℃水浴40min，期间每隔10min摇晃混匀；
13、s202、水浴后加入等体积氯仿：异戊醇抽提5min，离心5min，离心机转速为12000r/min，取200μl上清液加入预冷过的等体积异丙醇中，-20℃冰箱中静置20min；
14、s203、静置后进行离心提取，离心机转速为12000r/min，离心时间为10min，弃除上清液；加入150μl预冷过的乙醇后进行离心，离心机转速为12000r/min，离心时间为5min，弃除上清液；最后在100ul超纯水溶解dna，用微量分光光度计检测dna质量。
15、作为本专利技术再进一步的方案：pcr扩增体系使用20μlpcr反应体系，20ulpcr反应体系包括2μl1xpcr-buffer；2uldntps，dntps浓度为2.5mmol/l；2ul上下游混合引物，上下游混合引物浓度为2.5mmol/l,0.2μltaqdna聚合酶，taqdna聚合酶浓度为5u/μl,2μl模板dna，模板dna浓度为20ng/μl以及超纯水12μl。
16、作为本专利技术再进一步的方案：pcr扩增反应程序为：
17、程序一、94℃预变性3min，循环一次；
18、程序二、94℃变性10s，循环27次；
19、程序三、55℃退火10s,72℃延伸20s，循环30次；
20、程序四、72℃延伸5min，循环一次；
21、程序五、12℃保存。
22、作为本专利技术再进一步的方案：电泳检测的方法，包括以下步骤：
23、s301、配制聚丙烯酰胺凝胶；
24、s302、将聚丙烯酰胺凝胶灌注进入垂直电泳槽，插入0.75mm的梳子，待胶凝固后取下梳子，将pcr扩增产物加入聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量12μl，在120v与120ma条件下电泳3h，得到凝胶；
25、s303、待电泳结束，将凝胶浸入0.15％硝酸银中进行银染，银染条件为：100r/min染色4min；银染结束后将染色液全部倒出，双氧水漂洗20s，倒掉双氧水，加入1％氢氧化钠和0.037％甲醛混合溶液进行显色，显出条带时将显色液倒掉，加入双氧水漂洗，取出凝胶，拍照留存。
26、作为本专利技术再进一步的方案：步骤s301中，所述聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，包括以下步骤：
27、s401、用洗涤剂将玻璃板洗净，再用双氧水、无水乙醇分别擦洗两遍；玻璃板干燥后，将0.5ml亲和硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上，将0.5m剥离硅烷工作液均匀涂在带凹槽的短玻璃板上，操作过程中防止两块玻璃板互相污染。
28、s402、玻璃板彻底干燥后，将0.4mm厚塑料隔条整齐放在长玻璃板两侧，盖上凹槽短玻璃板，用夹子固定，再用水平仪检查玻璃胶室是否水平；
29、s403、取100ml质量分数6％的page胶溶液，加入50μl四甲基乙二胺和500μl质量分数10％的过硫酸铵，迅速混匀后灌入玻璃胶室，灌胶过程中防止出现气泡；待胶室灌满后，在凹槽处将0.4mm厚鲨鱼齿梳子平齐端向里轻轻插入胶液约4mm，室温聚合1h以上；胶聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，拔出梳子并用水清洗干净备用。
30、作为本专利技术再进一步的方案：还包括对梨杂交后代进行特异性测试，所述特异性测试包括田间形态种植鉴定、树体及枝条性状的观测分析、花性状的观测分析、果实及种子性状的观测分析。
31、作为本专利技术再进一步的方案：所述田间形态种植鉴定的方法为：在幼果期，根据幼果的果型、皮色和条带特征进行纯度鉴定。
32、作为本专利技术再进一步的方案：田间形态鉴定纯度＝种植总数-假杂种数/种植总数x100％。
33、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术采用基于ssr分子标记的pcr扩增与电泳检测的方法对梨杂交遗传纯度进行检测，检测过程便捷高效，检测结果准确，大大地提高杂交种苗遗传纯度的鉴定效率，从而为杂交种苗遗传纯度的快速鉴定建立起高效、准确的质量控制方法。
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1.一种梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，基因组DNA提取的方法为：选取目标品种的梨果实，将梨果实放在温度为25℃的环境中堆放5天，然后从梨果实中取出种子，温水浸种6h，置于恒温培养箱中28℃催芽，待根长2—3cm后采取根，提取根中的DNA。
3.根据权利要求2所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，提取根中DNA的方法，包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，PCR扩增体系使用20μLPCR反应体系，20uLPCR反应体系包括2μL1xPCR-Buffer、2uLdNTPs、2uL上下游混合引物、0.2μLTaqDNA聚合酶、2μL模板DNA以及超纯水12μL。
5.根据权利要求4所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，PCR扩增反应程序为：
6.根据权利要求1所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，电泳检测的方法，包括以下步骤：
7.根据权利要求1所述
8.根据权利要求1所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，还包括对梨杂交后代进行特异性测试，所述特异性测试包括田间形态种植鉴定、树体及枝条性状的观测分析、花性状的观测分析、果实及种子性状的观测分析。
9.根据权利要求8所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，所述田间形态种植鉴定的方法为：在幼果期，根据幼果的果型、皮色和条带特征进行纯度鉴定。
10.根据权利要求9所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，田间形态鉴定纯度＝种植总数-假杂种数/种植总数x100％。
...【技术特征摘要】
1.一种梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，基因组dna提取的方法为：选取目标品种的梨果实，将梨果实放在温度为25℃的环境中堆放5天，然后从梨果实中取出种子，温水浸种6h，置于恒温培养箱中28℃催芽，待根长2—3cm后采取根，提取根中的dna。
3.根据权利要求2所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，提取根中dna的方法，包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，其特征在于，pcr扩增体系使用20μlpcr反应体系，20ulpcr反应体系包括2μl1xpcr-buffer、2uldntps、2ul上下游混合引物、0.2μltaqdna聚合酶、2μl模板dna以及超纯水12μl。
5.根据权利要求4所述的梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜淑苓，欧春青，王斐，张艳杰，马力，
申请(专利权)人：中国农业科学院果树研究所，
类型：发明
国别省市：
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