【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核酸检测领域，具体涉及一种防止核酸扩增中气溶胶污染的体系及其方法与应用。
技术介绍
1、核酸气溶胶污染是实验室中极易出现的一种空气污染。空气与液体的液面摩擦，离心机离心，剧烈震荡反应管，反应管开盖，移液器反复吸样等情况均会产生核酸气溶胶，而极微量的核酸气溶胶污染即可形成假阳性结果。尿嘧啶-dna糖基酶（udg）可有效消除核酸扩增产物造成的气溶胶污染。它能够选择性水解断裂含有脱氧尿嘧啶核苷（du）的双链或单链dna中的尿嘧啶糖苷键，形成有缺失碱基的dna链，该缺失碱基的dna链在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂成为单链核苷酸。由于udg底物专一性，在核酸扩增体系中使用dutp能够有效区分气溶胶污染和模板，因为udg可以切割扩增产物中尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的n-糖基键从而降解气溶胶污染，而对模板不产生影响。因此udg/dutp系统能够有效消除核酸扩增产物造成的气溶胶污染，是广泛应用于定量pcr检测试剂盒的关键酶原料。
2、但是，在检测基因甲基化的核酸扩增体系中，udg的使用就遇到了困难。重亚硫酸盐转化法是目前应用最为广泛的cpg甲基化检测方法。该方法采用na2s205处理样本dna，将没有发生甲基化的胞嘧啶（c）转化为尿嘧啶（u），而发生甲基化的胞嘧啶（mc）保持不变；经过pcr扩增后，u转变为t，而mc转变为c，从而将基因组上的甲基化和非甲基化的差异转变成为c/t碱基的多态性，通过检测目标位点上的c/t碱基状态，就可以确定是否存在基因的甲基化。基于重亚硫酸盐转化的甲基化检测方法多种多样，比如bsp克隆
3、公开号为cn107488721a的中国专利中公开了一种消除pcr产物污染的甲基化扩增方法及其应用，通过在pcr反应前进行分体系、分步热处理，应用udg，解决甲基化扩增pcr产物的污染问题，然而该方法依赖于采用热熔材料预先包埋碱性溶液的pcr反应管，并且该技术并不能通用于其他核酸扩增技术。因此有必要建立一种简便的、通用的、不受模板限制的防止核酸扩增中气溶胶污染的体系及其方法。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种防止核酸扩增中气溶胶污染的体系及其方法与应用。
2、术语：
3、ditp：脱氧次黄苷三磷酸。
4、datp：脱氧腺苷三磷酸。
5、dgtp：脱氧鸟苷三磷酸。
6、dctp：脱氧胞苷三磷酸。
7、dttp：脱氧胸苷三磷酸。
8、dutp：脱氧尿苷三磷酸。
9、dntp mix：datp、dctp、dgtp和dttp的预混溶液。
10、一方面，本专利技术提供了一种防止核酸扩增中气溶胶污染的体系。
11、具体地，所述体系包括ditp和dna修复酶，所述ditp分别对核酸扩增体系中的datp、dgtp、dctp或dttp进行替换，替换比例为100：1-1：100，所述dna修复酶包括人烷基腺嘌呤dna糖基化酶、核酸内切酶ⅲ、核酸内切酶ⅳ、核酸内切酶v、核酸内切酶ⅷ中的至少一种。
12、优选地，所述ditp分别对核酸扩增体系中的datp、dgtp、dctp或dttp进行替换，替换比例为10：1-1：10。
13、具体地，所述体系还包括：0.1 mm-200 mm的tris-hcl、1 mm-400 mm的kcl、0.5mm-50 mm的mgso4、1 mm-300 mm的mgcl2、体积浓度0.1%-10%的tween-20、0.2 mm-200 mm的(nh4)2so4、0.02 mm-50 mm的dntp mix和引物。
14、优选地，所述体系还包括：1 mm-10 mm的tris-hcl、30-80 mm的kcl、0.5 mm-10 mm的mgso4、1 mm-10 mm的mgcl2、体积浓度0.1%-1%的tween-20、0.2 mm-10 mm的(nh4)2so4、0.02 mm-1 mm的dntp mix和引物。
15、在本专利技术的某些具体实施例中，所述体系中，各物质的用量和终浓度分别为：tris-hcl：10 mm；kcl：50 mm；mgso4：0.5 mm；mgcl2：1 mm；tween-20：0.5%；(nh4)2so4：10 mm；dna聚合酶：1 u；dttp，datp，dctp，dgtp各0.2 mm；β-actin基因上游引物、下游引物各1 µm；dna修复酶：1 u；ditp：0.2 mm；人基因组dna：2 µl；ddh2o：补足30 µl。
16、具体地，所述体系包括基于热循环和基于等温的核酸扩增反应体系。
17、进一步具体地，所述基于热循环的核酸扩增反应体系包括但不限于聚合酶链式反应（pcr）核酸扩增反应体系，所述基于等温的核酸扩增反应体系包括但不限于环介导等温扩增（lamp）、重组酶聚合酶扩增（rpa）、解旋酶依赖性扩增（hda）、链置换扩增（sda）、滚环扩增（rca）反应体系。
18、在一些可选的具体示例中，所述的pcr核酸扩增反应体系包括pcr核酸扩增反应液。
19、优选地，pcr核酸扩增反应液包括0.1-50 u dna聚合酶。
20、在本专利技术的某些具体实施例中，pcr核酸扩增反应液包括1 u dna聚合酶。
21、在一些可选的具体示例中，所述的lamp核酸扩增反应体系包括lamp核酸扩增反应液。
22、优选地，lamp核酸扩增反应液包括0.1-50 u链置换dna聚合酶。
23、在一些可选的具体示例中，所述的rpa核酸扩增反应体系包括rpa核酸扩增反应液。
24、优选地，rpa核酸扩增反应液包括0.1-50 u重组酶，0.1-50 u单链dna结合蛋白，0.1-50 u链置换dna聚合酶。
25、在一些可选的具体示例中，所述的hda核酸扩增反应体系包括hda核酸扩增反应液。
26、优选地，hda核酸扩增反应液包括0.1-50 u解旋酶，0.1-50 u单链dna结合蛋白，0.1-50 u链置换dna聚合酶。
27、在一些可选的具体示例中，所述的sda核酸扩增反应体系包括sda核酸扩增反应液。
28、优选地，sda核酸扩增反应液包括0.1-50 u限制性核酸内切酶，0.1-50 u链置换dna聚合酶。
29、在一些可选的具体示例中，所述的rca核酸扩增反应体系包括rca核酸扩增反应液。
30、优选地，r本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种防止核酸扩增中气溶胶污染的体系，其特征在于，所述体系包括dITP和DNA修复酶，所述dITP分别对核酸扩增体系中的dATP、dGTP、dCTP或dTTP进行替换，替换比例为100：1-1：100，所述DNA修复酶包括人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶、核酸内切酶Ⅲ、核酸内切酶Ⅳ、核酸内切酶V、核酸内切酶Ⅷ中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述体系还包括：0.1 mM-200 mM的Tris-HCl、1 mM-400 mM的KCl、0.5 mM-50 mM的MgSO4、1 mM-300 mM的MgCl2、体积浓度0.1%-10%的Tween-20、0.2 mM-200 mM的(NH4)2SO4、0.02 mM-50 mM的dNTP mix和引物。
3.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述体系包括基于热循环和基于等温的核酸扩增反应体系。
4.根据权利要求3所述的体系，其特征在于，所述基于热循环的核酸扩增反应体系包括聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）扩增反应体系；所述基于等温的
5.权利要求1-4任一项所述的体系在防止核酸扩增中气溶胶污染中的应用。
6.一种防止核酸扩增中气溶胶污染的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的体系。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述模板包括天然的核酸以及含尿嘧啶的核酸，所述天然的核酸包括DNA和RNA，所述含尿嘧啶的核酸包括经重亚硫酸氢盐转化处理过的DNA。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的防污染处理为对扩增体系以16℃-65℃孵育0-180 min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的核酸扩增产物分析包括用定性或定量的方法对扩增产物进行下游应用和研究，所述定性或定量的方法包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、侧向流层析、Sanger测序、焦磷酸测序、二代测序、三代测序、扩增动力学曲线荧光监测、熔解曲线分析、紫外分光光度计测定、实时荧光定量、数字PCR定量、实时浊度定量。
...【技术特征摘要】
1.一种防止核酸扩增中气溶胶污染的体系，其特征在于，所述体系包括ditp和dna修复酶，所述ditp分别对核酸扩增体系中的datp、dgtp、dctp或dttp进行替换，替换比例为100：1-1：100，所述dna修复酶包括人烷基腺嘌呤dna糖基化酶、核酸内切酶ⅲ、核酸内切酶ⅳ、核酸内切酶v、核酸内切酶ⅷ中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述体系还包括：0.1 mm-200 mm的tris-hcl、1 mm-400 mm的kcl、0.5 mm-50 mm的mgso4、1 mm-300 mm的mgcl2、体积浓度0.1%-10%的tween-20、0.2 mm-200 mm的(nh4)2so4、0.02 mm-50 mm的dntp mix和引物。
3.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述体系包括基于热循环和基于等温的核酸扩增反应体系。
4.根据权利要求3所述的体系，其特征在于，所述基于热循环的核酸扩增反应体系包括聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, pcr）扩增反应体系；所述基于等温的核酸扩增反应体系包括环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, lamp）、重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, rpa）、解旋酶依赖性...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘枭男，周浒云，胡文静，张佳幸，严江伟，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：
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