【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病原体检测，更具体的说是涉及牛支原体的raa-crispr检测方法及应用。
技术介绍
1、牛支原体是引起牛呼吸道疾病的主要病原体之一。牛支原体分离困难，周期长，不能进行快速临床诊断，并对操作人员具有一定的要求，限制了该方法的广泛应用。分子生物学诊断、血清学诊断是目前较为理想的检测牛支原体的方式，但因需要昂贵的仪器设备、繁琐的操作过程、灵敏度低等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided amplification,以下简称raa)，具有良好的灵敏性和简便性，已广泛应用于不同疾病的快速检测，但单检测的方法存在假阳性的可能。
2、将raa技术与crispr/cas系统的反式切割活性相结合的方法操作简便，准确性高，结果容易判读且应用范围广，可以实现对病原的快速检测且不受以上条件限制。目前尚未有将raa技术结合crispr系统用于牛支原体的检测的报道。
3、综上，如何提供一种基于raa-crispr/cas12a技术的快速检测牛支原体的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了牛支原体的raa-crispr检测方法及应用。
2、本专利技术根据牛支原体特异性oppd/f基因设计1对引物，利用raa技术，在39℃等温扩增25min，其扩增产物作为该方法反应体系的模板，raa-crispr/cas12a扩增反应体系反应组分，在37℃反应10min，根据试纸
3、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
4、第一方面，本专利技术提供了牛支原体的raa引物对，其核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.2所示；
5、上游raa引物：tgaacaaatacgtcaagagtacaatatatcaa，seq id no.1；
6、下游raa引物：tagtcaatttctaaggcaaagtcatttctagg，seq id no.2。
7、第二方面，本专利技术提供了基于crispr/cas技术检测牛支原体的grna，其核苷酸序列如seq id no.3所示；
8、aauuucuacuaaguguagaugcauaacauuaguguugucg，seq id no.3。
9、第三方面，本专利技术提供了牛支原体的raa-crispr/cas反应体系，包括上述的raa引物对和上述的grna。
10、优选的，还包括crispr-lfa ssdna reporter和cas12a蛋白。
11、优选的，所述cas12a蛋白的浓度为200nm。
12、优选的，所述cas12a蛋白与grna的体积比为2：1。
13、优选的，所述crispr-lfa ssdna reporter的添加量为1μl。
14、第四方面，本专利技术提供了一种检测牛支原体的试剂盒，含有上述的raa引物对或上述的grna或上述的反应体系。
15、第五方面，本专利技术提供了一种非疾病诊断和治疗目的的检测牛支原体的方法，获得待测样品dna进行raa扩增，其扩增产物作为模板，使用raa-crispr/cas12a反应体系进行反应，之后进行结果判定。
16、进一步的，包括如下步骤：
17、(1)提取待检样品的dna；
18、(2)raa扩增反应：
19、反应体系：a buffer 14.7μl，引物f(10μm)1μl，引物r(10μm)1μl，模板2μl，启动液b buffer 1.3μl，用ddh2o补齐到25μl。反应条件为39℃反应25min，得raa扩增产物；
20、(3)raa结合crispr/cas12a扩增反应：
21、反应体系：1×holmes buffer 12μl，cas12a(200nm)0.4μl，grna(10μm)0.8μl，tolobio公司的crispr-lfa ssdna reporter 1μl，raa扩增产物4μl，用ddh2o补齐到20μl。反应条件为37℃反应10min；
22、(4)结果判断：上述反应结束后向反应管中加入30μl ddh2o稀释扩增产物，使用tolobio公司的crispr单系统检测试纸条(fam/fitc)孵育5min后观察试纸条显色情况，若检测线显色则为牛支原体。
23、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果为：本专利技术方法方便快捷，能在34℃～42℃，较短的时间内检测牛支原体，且不依赖于昂贵的仪器设备，灵敏度高，特异性好，对于牛支原体感染的临床快速诊断具有较高的参考价值，适于推广应用。
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1.牛支原体的RAA引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；
2.基于CRISPR/Cas技术检测牛支原体的gRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
3.牛支原体的RAA-CRISPR/Cas反应体系，其特征在于，包括权利要求1所述的RAA引物对和权利要求2所述的gRNA。
4.如权利要求3所述的反应体系，其特征在于，还包括CRISPR-LFA ssDNA reporter和Cas12a蛋白。
5.如权利要求4所述的反应体系，其特征在于，所述Cas12a蛋白的浓度为200nM。
6.如权利要求4所述的反应体系，其特征在于，所述Cas12a蛋白与gRNA的体积比为2:1。
7.如权利要求4所述的反应体系，其特征在于，所述CRISPR-LFA ssDNA reporter的添加量为1μL。
8.一种检测牛支原体的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的RAA引物对或权利要求2所述的gRNA或权利要求3～7任一所述的反应体系。
<...【技术特征摘要】
1.牛支原体的raa引物对，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.2所示；
2.基于crispr/cas技术检测牛支原体的grna，其特征在于，其核苷酸序列如seq idno.3所示；
3.牛支原体的raa-crispr/cas反应体系，其特征在于，包括权利要求1所述的raa引物对和权利要求2所述的grna。
4.如权利要求3所述的反应体系，其特征在于，还包括crispr-lfa ssdna reporter和cas12a蛋白。
5.如权利要求4所述的反应体系，其特征在于，所述cas12a蛋白的浓度为...
【专利技术属性】
技术研发人员：周伟光，邹美娟，希尼尼根，张志丹，杨林，旭芬，侯琳，张嘉磊，齐力格尔，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：
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