【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于海产品功能应用、功能食品及生物，更具体地，涉及一种薛氏海龙蛋白来源的短肽、筛选及其应用。
技术介绍
1、良性前列腺增生(bph)是指一种涉及尿道周围前列腺的良性腺瘤样增生的疾病，该疾病属于男性中老年常见疾病之一，随全球人口老年化发病日渐增多，良性前列腺增生的发病率也随年龄递增，研究表明每十年患病率增加10％，而50岁以上男性的发病率高达50％，80岁以上男性的发病率高达80％，因此，该疾病已经严重影响了中老年男性的生活质量，已成为一个迫切需要关注的普遍健康问题。
2、目前bph的机制尚不完全清楚，雄激素如睾酮(tp)和二氢睾酮(dht)被认为是与其有关的重要因素，因此bph的治疗目标包括使良性前列腺营养水平正常化、类固醇激素恢复到正常水平、抑制二氢睾酮过量产生、减少炎症过程以及限制增生过程的启动子。当前bph的药物治疗包括α受体阻滞剂，peeis和5α还原酶抑制剂。α-ar拮抗剂通过放松患者膀胱和前列腺周围的肌肉以便患者更容易排尿。然而，有如头痛、嗜睡和头晕的副作用，而对前列腺的大小没有减少作用。同时5α还原酶抑制剂通过抑制5α还原酶的活性起作用，抑制dht的产生从而抑制前列腺过度生长。然而，5α还原酶抑制剂也出现导致性功能障碍，包括勃起功能障碍，减退或射精减少。研究发现正常的前列腺是由有限数量的炎症细胞组成的免疫功能正常器官，前列腺慢性炎症可能与激素改变、感染、饮食或环境因素、自身免疫反应、前列腺集合管内尿反流以及与代谢综合征相关的全身炎症有关。几种内源性多肽如血管活性肠肽(vip)、a-促黑素细胞激
3、而据大量的研究报告可知海龙是一种传统的补益中药，具有温肾壮阳、散结消肿的作用，并且海龙中蛋白质的总量高达50％以上，是蛋白或肽类活性物的优质来源。其中，薛氏海龙是中国近海分布的一种优势的海龙科鱼类，资源量丰富。传统发现生物活性肽的方法，包括了广泛的活性评估引导的分级分离和纯化过程，繁琐、耗时且不易成功。而生物信息学不仅有助于预测任何已知蛋白质来源的生物活性肽的形成，预测活性肽作用靶点及活性，实现高通量精准筛选。因此，传统方法结合生物信息学，能有效快速精准筛选生物活性肽。
技术实现思路
1、本专利技术基于前期研究基础，在获得薛氏海龙活性肽组分，基于生物信息学方法，构建薛氏海龙肽抑制良性前列腺增生的靶点集合和互作网络，预测活性肽序列，明确核心生物学过程及作用靶点，建立对应的rwpe-1细胞模型，验证薛氏海龙活性肽序列，并运用多组学联合分析结合现代药理学评价方法阐明薛氏海龙活性肽抑制良性前列腺增生的功效机制，也为海龙的高值化利用提供理论基础。
2、本专利技术的首要目的是为了克服现有技术中存在上述问题，首先提供一种薛氏海龙蛋白来源的短肽。
3、本专利技术的第二个目的是提供薛氏海龙蛋白来源的短肽在制备缓解良性前列腺增生、补肾壮阳和克服阳痿少精的功能产品中的应用。
4、本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
5、一种薛氏海龙蛋白来源的短肽，所述短肽的氨基酸序列分别如下所示：
6、i)fvdw(phe-val-asp-trp)；
7、ii)fife(phe-ile-phe-glu)。
8、本专利技术还提供上述薛氏海龙蛋白来源的短肽的筛选方法，包括以下步骤:
9、(1)多肽制备及序列鉴定：利用中性蛋白酶酶解脱脂薛氏海龙粉制备薛氏海龙肽，纯化后的多肽利用液质联用和蛋白质组学方法，鉴定薛氏海龙粉中性蛋白酶水解物的凝胶分离第4个(sn4)组分中小分子肽的氨基酸序列；
10、(2)活性肽序列筛选：第4个(sn4)组分中所有肽序列，经网络药理学与分子对接技术虚拟筛选，后由cck8法检测rwpe-1细胞增殖情况，获得抑制良性前列腺增生的活性短肽氨基酸序列为fvdw、fife；
11、(3)细胞验证：上述短肽序列，使用固相法化学合成，利用人前列腺上皮细胞rwpe-1进行体外模型验证其抑制细胞增殖活性。
12、优选的，步骤(1)的操作，具体方法如下：
13、①酶解：
14、取脱脂薛氏海龙粉，按照料液比1:10加入蒸馏水，调节ph为6.5，在水解温度下预热后，加入3000u/g中性蛋白酶，50℃酶解5小时，酶解后取出100℃沸水浴灭酶10分钟，离心，8000r/min离心15min取上清液，收集上清液；
15、②分离
16、收集的上清液依次用0.2μm和5kda超滤膜超滤，取<5k da滤过液浓缩，冷冻干燥，得中性蛋白酶水解薛氏海龙多肽冻干粉，标记为sn；
17、③纯化
18、取中性蛋白酶水解薛氏海龙多肽冻干粉溶解，经sephadex g-15柱层析纯化洗脱，共收集得到6个组分样品(sn1-6)，收集后浓缩冷冻干燥保存；
19、④sn1-6活性验证及流式细胞仪分析
20、采用cck8法检测sn1-6干预rwpe-1细胞各存活率情况，流式细胞仪分析细胞周期与细胞凋亡，保存筛选到抑制细胞增殖活性最好的第四个组分(sn4)；
21、rwpe-1细胞以1×105个细胞/ml的密度接种，粘附24小时。在含有tp的培养基中用sn处理细胞，孵育24小时后，收获每孔中的细胞并以200×g离心5分钟。用pbs洗涤细胞并再次以200×g离心5分钟。接下来，将细胞重悬于100μl结合缓冲液中，并用5μl膜联蛋白v-fitc和5μlpi染色。添加每种染色试剂后，将样品在黑暗中在冰上孵育15分钟。随后加入300μl结合缓冲液，采用流式细胞术检测凋亡细胞；
22、细胞最初以1×105个细胞/ml的密度接种到12孔板中，并粘附24小时。此后，将细胞进一步在含有pe或fi的新鲜tp培养基中进一步孵育，并再孵育24小时。随后，收获细胞、洗涤并在-20℃下用pbs中的70％乙醇固定。过夜孵育后，将固定的细胞沉淀，并在rnase a(40μg/ml)和0.1％triton x-100存在下，于37℃避光条件下用碘化丙啶(25μg/ml)染色。最后，在30分钟的孵育期后通过流式细胞术分析细胞周期。
23、⑤lc-ms/ms鉴定多肽氨基酸序列
24、在制备好的sn4海龙肽中加入裂解液8m urea,1xprotease inhibitor cocktail(roche ltd.basel,swizerland)，震荡研磨，冰上裂解30min。高速离心15min(4℃,15000rpm)，取上本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种薛氏海龙蛋白来源的短肽，其特征在于，所述短肽的氨基酸序列为以下序列的任一种或组合：
2.根据权利要求1所述的短肽，其特征在于，所述短肽还含有如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有相同功能的序列。
3.权利要求1所述薛氏海龙蛋白来源的短肽在制备防治良性前列腺增生的功能产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述短肽在功能产品中的浓度为1～100μg/mL。
5.一种生物制品，其特征在于，所述生物制品为：
6.根据权利要求5所述的生物制品，其特征在于，所述活性成分含有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有相同功能的序列。
7.权利要求5所述的生物制品在制备预防、改善或治疗良性前列腺增生、补肾壮阳或克服阳痿少精的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品为保健品、营养品、特医食品或药物。
9.根据权利要求8所述
...【技术特征摘要】
1.一种薛氏海龙蛋白来源的短肽，其特征在于，所述短肽的氨基酸序列为以下序列的任一种或组合：
2.根据权利要求1所述的短肽，其特征在于，所述短肽还含有如seq id no.1或seq idno.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有相同功能的序列。
3.权利要求1所述薛氏海龙蛋白来源的短肽在制备防治良性前列腺增生的功能产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述短肽在功能产品中的浓度为1～100μg/ml。
5.一种生物制品，其特征在于，所述生物制品...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘剑宇，段艾伶，蔡冰娜，林强，秦耿，黎思，陈华，万鹏，陈得科，孙恢礼，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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