【技术实现步骤摘要】
本公开涉及生物领域，更具体地，涉及一种大肠杆菌重组蛋白的纯化方法。
技术介绍
1、大肠杆菌是基因工程中最常用的一种原核微生物，由于其遗传背景清楚，易于培养，生长迅速而倍受生物、基因工程专家的青睐，常被作为外源基因表达的宿主，也是目前应用最广泛、表达最成功的体系。已使用其成功表达重组胰岛素、干扰素、白介素以及表皮生长因子等多种极具医药价值的活性蛋白质产品。由于很多重组基因表达的蛋白质产物都存在于大肠杆菌细胞内部，所以必须对大肠杆菌细胞进行破壁后使这些重组蛋白释放出来，再进行后续的分离纯化，最后获取所需的目的蛋白。
2、在细胞内重组表达目的蛋白的过程中，核酸是一类常见的杂质成分，尤其当目的蛋白具有核酸结合活性时，核酸污染更容易出现。目的样品中残留的、宿主细胞来源的核酸片段，可能会产生增加样品的粘度，在纯化过程中引入其他杂质等问题。
3、重组蛋白质的上游纯化一直是限制其生产的瓶颈环节。传统的工业生产中所使用的离心机体型庞大且多以批次模式运行存在诸多缺陷，首先是设备制造及运行成本较高，而且它们所能达到的转速有限，无法达到现代纯化工艺对高分辨率纯化的要求，其次是批次模式导致产物回收率和处理效率较低。连续离心机的开发有效克服了传统批次离心机的缺陷，但是对于工业生产的使用人们还是偏向于使用连续过滤技术，对比连续离心技术，连续过滤技术的在线过程控制和连续处理能力要普遍优于离心机。但它也有操作条件不稳定，高剪切力，处理效率低等缺点。
技术实现思路
1、本公开提供了一种高效破碎
2、本公开提供了一种大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，包括以下步骤：构建核糖核酸酶-溶菌酶融合酶(简称融合酶)的重组表达载体；将所述融合酶的重组表达载体转化到大肠杆菌中，诱导融合酶表达；对表达有融合酶的大肠杆菌进行超声破碎，离心，将上清作为融合酶的粗酶液；构建目的蛋白的重组表达载体；将所述目的蛋白的重组表达载体转化到大肠杆菌中，诱导目的蛋白表达；将所述粗酶液加入到表达有目的蛋白的大肠杆菌菌液中，孵育；在所述孵育之后，加入nacl，然后加入聚乙烯亚胺，磁力搅拌，静置，抽滤，取上清。
3、在一些实施例中，所述融合酶是含有麦芽糖结合蛋白(mbp)标签的金黄色葡萄球菌核糖核酸酶(staphylococcal nuclease，sn)和t4溶菌酶(t4 lysozyme，t4l)的重组蛋白。该融合酶可以溶解大肠杆菌细胞壁和dna/rna。金黄色葡萄球菌核糖核酸酶(staphylococcus nuclease,sn),又名微球菌核酸酶,是由金黄色葡萄球菌分泌的一种胞外核酸非专一性磷酸二酯酶,对单链或双链dna或rna均有较强的降解能力。该酶结构简单,仅由1条单肽链组成,长约149个氨基酸,不含半胱氨酸和二硫键,能够可逆地去折叠和重折叠,是研究蛋白质结构与功能的关系,蛋白质折叠和动力学的重要模型。t4l是一种由t4噬菌体感染大肠杆菌时释放的酶，由于大肠杆菌工程菌应用广泛，遗传清晰，因此该溶菌酶有低成本、易获得的优点，又因为所纯化目的蛋白的表达载体常为大肠杆菌，故使用此种溶菌酶可以有效避免引入其他菌种的干扰。同时t4l可以特异和高效的溶解细菌细胞壁的肽聚糖，导致大肠杆菌细胞壁的破裂和溶解，而不溶解目的蛋白。
4、在一些实施例中，所述目的蛋白为3-甾酮-δ1-脱氢酶(kstd)。
5、在一些实施例中，所述孵育为在37℃孵育60-90min。3-甾酮-δ1-脱氢酶的最适温度为37℃，最适ph为7-8.5，在37℃下进行孵育，能够减小对目的蛋白kstd的活性的不利影响，温度过高或过低容易导致目的蛋白kstd失活。另外，孵育时间过短，不利于充分破碎大肠杆菌，释放目的蛋白，孵育时间过长，影响目的蛋白纯化效率。
6、在一些实施例中，在加入nacl之后，nacl终浓度为0.9mol/l至1.1mol/l。聚乙烯亚胺是一种碱性阳离子聚合物，在1mol/l左右的nacl下，会沉淀核酸而几乎不沉淀蛋白，而低于此浓度，目的蛋白可能会被沉淀。
7、在一些实施例中，所述聚乙烯亚胺的分子量为10000，所述聚乙烯亚胺用去离子水溶解成10％(m/v％)的溶液，然后用稀盐酸调ph至7.7。调节高盐离子浓度使聚乙烯亚仅沉淀核酸而尽可能减小对目的蛋白的影响。在实际应用中，常用的聚乙烯亚胺分子量通常在一万到十万之间。随着聚乙烯亚胺分子量的增大，其相对分子质量、密度和粘度也会随之增大。此外，由于高分子量的聚乙烯亚胺分子链越来越长，因此其溶剂化能力和溶解度会降低。为避免聚乙烯亚胺增加融合酶粗酶液的粘度，故采用尽可能较小的分子量作为实验试剂。
8、在一些实施例中，在加入聚乙烯亚胺之后，所述聚乙烯亚胺的体积终浓度为0.1％至0.3％。观察上清与沉淀sds-page结果可以发现，加入不同浓度的聚乙烯亚胺后在小于0.25％终浓度时，加入聚乙烯亚胺的浓度越高，上清中保留的目的蛋白越多，而超过这个浓度，目的蛋白含量减少，浓度为0.25％时，上清中的蛋白含量与离心方式所得上清中蛋白含量相似，而沉淀中含量很少。这可能是过量的聚乙烯亚胺残留在上清中，影响了目的蛋白的测定。
9、在一些实施例中，所述磁力搅拌为以150-200rpm搅拌10-30min。
10、在一些实施例中，所述静置的时间为0.3-3h。搅拌后观察絮凝物沉降速度发现，搅拌组与对照组相比，絮凝物产生与沉降速度都明显加快，搅拌时间对最终上清中目的蛋白含量的影响不大，计时发现磁力搅拌器搅拌30min后，粗酶液样品静置10min即出现明显分层，20min絮凝物即可以认为完全沉降，与不搅拌组相比沉降时间缩短了近7h，因此后续实验采用磁力搅拌器200rpm、室温搅拌30min、静置20min的实验条件。推测搅拌后沉降速度加快，可能是因为搅拌加快了聚乙烯亚胺与杂质蛋白的结合速率与结合面积，使得絮凝物产生速度加快，絮凝体积增大，受重力作用增强，沉降加快。
11、在一些实施例中，所述抽滤为真空抽滤。
12、在一些实施例中，所述抽滤为板框压滤。
13、本公开提供的纯化方法无需使用现有批次离心或多次过滤方式，直接一步过滤即可有效去除菌液中大量的核酸，降低液体粘度，有利于下一步反应的进行或直接用于后续酶反应，且不影响目的蛋白活性，方便目的蛋白的进一步纯化。
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1.一种大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述融合酶是含有麦芽糖结合蛋白标签的金黄色葡萄球菌核糖核酸酶和T4溶菌酶的重组融合蛋白。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述目的蛋白为3-甾酮-Δ1-脱氢酶。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述孵育为在37℃孵育60-90min。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，其特征在于，在加入NaCl之后，NaCl终浓度为0.9mol/L至1.1mol/L。
6.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺的分子量为10000，所述聚乙烯亚胺用去离子水溶解成质量体积比为10％的溶液，然后用稀盐酸调pH至7.7。
7.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，其特征在于，在加入聚乙烯亚胺之后，所述聚乙烯亚胺的体积终浓度为0.1％至0.3％。
8.根据权利要求1所述
9.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述静置的时间为0.3-3h。
10.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述抽滤为真空抽滤或板框压滤。
...【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述融合酶是含有麦芽糖结合蛋白标签的金黄色葡萄球菌核糖核酸酶和t4溶菌酶的重组融合蛋白。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述目的蛋白为3-甾酮-δ1-脱氢酶。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述孵育为在37℃孵育60-90min。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组蛋白的纯化方法，其特征在于，在加入nacl之后，nacl终浓度为0.9mol/l至1.1mol/l。
6.根据权利要求1所述的大肠杆...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏正定，宋士奎，崔雨，马倩倩，
申请(专利权)人：武汉艾默佳华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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