【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用sn-1,3位脂肪酶和sn-2位脂肪酶组合从底物产生脂肪酸烷基酯的方法，该组合有利于将游离脂肪酸和/或甘油三酯转化为脂肪酸烷基酯。
技术介绍
1、生物柴油通常被归类为油脂的单烷基酯，由于其环境效益，最近变得越来越有吸引力。尽管生物柴油目前已成功地通过化学方法(例如使用naoh和/或甲醇钠作为催化剂)生产出来，但仍有一些相关问题限制了其发展，例如由于游离脂肪酸含量高而需要对油进行预处理、从酯和甘油相中去除化学催化剂以及在甘油回收过程中去除无机盐。
2、使用脂肪分解酶作为催化剂在很大程度上避免了由化学催化剂导致的不利因素，并且近年来人们开始关注在转酯基作用中使用固定化或未固定化的脂肪酶来生产生物柴油。
3、真菌酯酶可以用于酯的酶促生产中，其中真菌酯酶可替代催化剂如无机酸(例如，硫酸、氯化氢和氯磺酸)，i、ii、iii和iv族金属的两性氢氧化物等。在现有技术中已经描述了酶用于酯合成的用途，特别是根据酶命名法(recommendations of the nomenclaturecommittee of the international union of biochemistry and molecular biology[国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会的建议]，1992年或以后)分类为ec 3.1.1羧酸酯水解酶的酶。
4、wo 88/02775披露了来自南极假丝酵母(candida antarctica)的脂肪酶a和b。该披露称南极假丝酵母脂肪酶b(calb)对于酯合
5、角质酶是能够水解底物角质的脂肪分解酶。已知角质酶来自多种真菌(p.e.kolattukudy,“lipases[酯酶]”,编辑b.和h.l.brockman,elsevier[爱思唯尔],1984,471-504)。来自特异腐质霉(humicola insolens)的角质酶的氨基酸序列已被公布(us 5,827,719)。
6、众所周知，过多的短链醇(如甲醇)可能严重地导致脂肪酶失活。然而，为了将油完全转化成其相应的甲酯，需要基于甘油三酯的至少三摩尔当量的甲醇。du等人(biotechnol.appl.biochem.[生物技术与应用生物化学]2003,38:103-106)研究了在不连续分批和连续分批操作期间油/甲醇摩尔比的影响。
7、为了避免脂肪酶失活，通过在整个反应中逐步添加甲醇来保持低的甲醇浓度(shimada等人,j mol.catalysis enzymatic[分子催化学报：酶催化],2002,17:133-142；xu等人,2004,biocat.biotransform.[生物催化和生物转化],22:45-48)。
8、boutur等人(j.biotechnol.[生物技术杂志],1995,42:23-33)报道了一种来自畸形假丝酵母(candida deformans)的脂肪酶，其既能催化甘油三酯(tg)的醇解，又能催化游离脂肪酸(ffa)的酯化，但不是在相同的反应条件下。在boutur等人描述的条件下，酶只催化酯化。
9、为了实现更经济地生产用于生物柴油的脂肪酸乙酯，人们需要将油脂更快地转化成它们相应的甲酯，并在所述转化中实现更高的产量。
技术实现思路
1、本专利技术涉及用于产生脂肪酸烷基酯的方法。该方法包括以下步骤：a)提供主要包含甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、游离脂肪酸或其任何组合的底物，以及b)使该底物与包含sn-1,3位脂肪酶和sn-2位脂肪酶的酶组合物反应以产生脂肪酸烷基酯。
2、本专利技术还涉及用于产生脂肪酸烷基酯的酶组合物，该酶组合物包含sn-1,3位脂肪酶和sn-2位脂肪酶。
3、本专利技术使用非特异性脂肪酶的组合，该组合也催化具有低比活性的sn-2位的反应。该非特异性脂肪酶可以通过取代部分快速sn-1,3位脂肪酶来出人意料地启动反应速率和转化。
4、从下面的描述中，本专利技术的这些和其他目的和优点将是显而易见的。在下面的详细描述中，将参考附图描述本专利技术的优选实施例。这些实施例不代表本专利技术的全部范围。相反，本专利技术可用于其他实施例。因此，应当参考本文的权利要求书来解释本专利技术的广度。
5、定义
6、在披露和描述本专利技术的特定实施例之前，应当理解，本专利技术不限于本文披露的特定过程和材料，因为它们可以在一定程度上变化。还应理解的是，本文所使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在具有限制性，因为本专利技术的范围将仅由所附权利要求及其等效物限制。
7、在描述和要求保护本专利技术时，将使用以下术语。
8、单数形式“一种/个(a/an)”以及“该/这些(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“步骤”包括提及一个或多个这样的步骤。
9、如本文所用，“大量”当用于提及材料的数量或量或其特别特性时，是指足以提供该材料或特性想要提供的效果的量。在某些情况下，允许的准确偏差程度可能取决于特别情况。类似地，“基本上不含”等是指组合物中不含确定的元素或试剂。特别地，被确定为“基本上不含”的元素要么完全不存在于组合物中要么仅以足够小的量被包含以便对组合物没有有害影响。
10、本文提及“约”值或参数包括指向该值或参数本身的实施例。例如，提及“约x”的描述包括实施例“x”。当与测量值组合使用时，“约”包括涵盖至少与测量该特定数值的方法相关的不确定性的范围，并且可以包括在给定的数值附近正或负两个标准差的范围。
11、同样，提及“衍生自”另一个基因或多肽x的基因或多肽包括该基因或多肽x。
12、应该理解的是本文所述的实施例包括“由……实施例组成”和/或“基本由……实施例组成”。如本文所用，除了由于表达语言或必需含义情况下另有要求外，词语“包含(comprise)”或变形如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”以包容性意义使用，即指定所述特征的存在，但不排除各种实施例中存在或添加了其他特征。
13、浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围形式呈现。应当理解，这样的范围形式仅仅是为了方便和简洁而使用的，并且应灵活地解释为不仅包括明确列举为范围界限的数值，而且还包括涵盖在该范围内的所有单独数值或子范围，如同明确列举每个数值和子范围。例如，约1％至约20％的重量范围应被解释为不仅包括明确列举的1％至约20％的浓度极限，还包括诸如2％、3％、4％的单独浓度，以及诸如5％至15％、10％至20％等的子范围。
14、脂质：术语“脂质”是指磷脂及其衍生物、甘油三酯和衍生物、甾醇、甾烷醇、胆固醇、鞘脂、神经酰胺、脂肪酸、脂肪醇、糖脂、蛋白脂质、脂多糖、醚-脂质、极性和非极性脂质及其衍生物。
15、酯化：如本文所用，术语“酯化”是用于将有机酸(如脂肪酸)与任何醇或多元醇(如甘油)组合的反应。
16、水解：如本文所用，术语“本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于产生脂肪酸烷基酯的方法，该方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括：在酶或酸的存在下通过皂化和/或酯化对步骤b)中所产生的脂肪酸烷基酯中的游离脂肪酸进行还原，随后分离并且任选地回收甘油。
3.如前述段落中任一项所述的方法，其中在步骤b)期间添加醇和任选地水。
4.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述醇是C1-C5醇，优选甲醇、乙醇、丙醇、或其混合物。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该底物源自于以下中的一种或多种：海藻油；低芥酸菜籽油；椰子油；蓖麻油；椰子油；椰子核油；玉米油；酒糟玉米油；棉花籽油；亚麻油；鱼油；葡萄籽油；大麻油；麻疯果油；荷荷芭油；芥子油；低芥酸菜籽油；棕榈油；棕榈硬脂；棕榈油精；棕榈仁油；花生油；菜籽油；米糠油；红花油；大豆油；向日葵油；妥尔油；来自盐生植物的油；和/或动物脂肪，包括来自猪、牛和羊的动物油脂、猪油、鸡脂肪、鱼油；棕榈油游离脂肪酸馏出物；豆油游离脂肪酸馏出物；皂原料脂肪酸材料；黄色油脂；用过的烹饪油；棕榈油废水；和褐色油脂或其任何组合。
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7.一种用于产生脂肪酸烷基酯的酶组合物，该酶组合物包含sn-1,3位脂肪酶和sn-2位脂肪酶，其中该sn-1,3位脂肪酶是与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的脂肪酶，并且其中该sn-2位脂肪酶是与SEQ ID NO:3具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的脂肪酶，其中所述脂肪酶是液体形式。
8.如权利要求4所述的组合物，其中该sn-1,3位脂肪酶和该sn-2位脂肪酶是微生物来源的，特别地是真菌或细菌来源的。
9.如权利要求4-5中任一项所述的组合物，其中该sn-1,3位脂肪酶和该sn-2位脂肪酶选自由以下组成的组:曲霉属脂肪酶；黑曲霉脂肪酶；疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶；南极假丝酵母脂肪酶A；南极假丝酵母脂肪酶B；圆柱假丝酵母脂肪酶；畸形假丝酵母脂肪酶；解脂假丝酵母脂肪酶；近平滑假丝酵母脂肪酶；米黑毛霉，皱褶假丝酵母脂肪酶；痤疮棒状杆菌脂肪酶；疏棉状腐质霉，隐球菌属物种S-2脂肪酶；大刀镰孢脂肪酶；异孢镰孢脂肪酶；尖孢镰孢脂肪酶；爪哇毛霉脂肪酶；米黑根毛霉脂肪酶；德氏根毛霉脂肪酶；洋葱伯克霍尔德菌属(洋葱假单胞菌)脂肪酶；假单胞菌属物种，ATCC 21808，沙门柏干酪假单胞菌脂肪酶；荧光假单胞菌脂肪酶；根霉属脂肪酶；少根根霉脂肪酶；金黄色葡萄球菌脂肪酶；念珠地丝菌脂肪酶；酵母样丝孢菌属物种脂肪酶；产酸克雷伯菌脂肪酶。
10.如权利要求7-9中任一项所述的酶组合物用于产生脂肪酸烷基酯的用途。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于产生脂肪酸烷基酯的方法，该方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括：在酶或酸的存在下通过皂化和/或酯化对步骤b)中所产生的脂肪酸烷基酯中的游离脂肪酸进行还原，随后分离并且任选地回收甘油。
3.如前述段落中任一项所述的方法，其中在步骤b)期间添加醇和任选地水。
4.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述醇是c1-c5醇，优选甲醇、乙醇、丙醇、或其混合物。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该底物源自于以下中的一种或多种：海藻油；低芥酸菜籽油；椰子油；蓖麻油；椰子油；椰子核油；玉米油；酒糟玉米油；棉花籽油；亚麻油；鱼油；葡萄籽油；大麻油；麻疯果油；荷荷芭油；芥子油；低芥酸菜籽油；棕榈油；棕榈硬脂；棕榈油精；棕榈仁油；花生油；菜籽油；米糠油；红花油；大豆油；向日葵油；妥尔油；来自盐生植物的油；和/或动物脂肪，包括来自猪、牛和羊的动物油脂、猪油、鸡脂肪、鱼油；棕榈油游离脂肪酸馏出物；豆油游离脂肪酸馏出物；皂原料脂肪酸材料；黄色油脂；用过的烹饪油；棕榈油废水；和褐色油脂或其任何组合。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述底物中至少80％、至少85％、至少90％或如至少95％的脂肪酸酰基基团或游离脂肪酸已经转化为脂肪酸烷基酯。
7.一种用于产生脂肪酸烷基酯的酶组合物，该酶组合物包含sn-1,3位脂肪酶和sn-2位脂肪酶，其中该sn-1,3位脂肪酶是与seq id no:1或seq id no:2具有至少60％、至少65％、至少70...
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