【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种高表达omput-lptdep联合抗原的弧菌基因工程活菌疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
1、我国是水产养殖大国，水产养殖业发展迅速。随着水产养殖的不断扩大，水产养殖动物病害频繁发生，其中以副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus)等弧菌引起的弧菌病(vibriosis)最为严重，对规模化养殖和发展造成了巨大的威胁，严重制约着水产养殖业的可持续健康发展。副溶血弧菌是一类常见的革兰氏阴性菌，广泛分布于世界各地沿海地区的河口和沿海水域，其最适生长环境为ph7.6～8.6，盐度为2～3，温度30～37℃。由该菌感染所引起的鱼、虾、蟹及贝类等的弧菌病是水产养殖动物最普遍流行且危害最大的细菌性疾病。同时，副溶血弧菌在我国仍是主要的食源性病原菌，夏秋季节是其导致食物中毒的高发阶段，人感染后会出现恶心、头痛、低烧、呕吐、腹泻等症状，严重的还会诱发肠胃炎或败血症。目前对弧菌的预防和治疗主要是依靠抗生素，但因长期大量使用抗生素，已引起抗药性，且导致抗生素在动物体内的富集，对人类健康造成危害。
2、近年来的研究表明暴露于细菌外表面的外膜蛋白具有良好的免疫原性及抗原性。因此，基于外膜蛋白为抗原的来研制疫苗来防治细菌性疾病是一种安全有效的方法，与其它防治途径相比，以疫苗为主的免疫防治有不可替代的优势。因而利用具高效保护性外膜蛋白来研制重组活载体细菌疫苗具有广阔的市场前景。定位于副溶血弧菌外膜的跨膜蛋白ompu为一种孔蛋白(porin)，其分子量约为34.3kda，为丰度较高的外膜蛋白，其功
3、同样定位于副溶血弧菌外膜的跨膜蛋白lptd(lps-assembly protein)的分子量约为86.6kda，其在外膜中的丰度较低。lptd是负责转运脂多糖(lps)跨过外膜并在细菌外表面组装的关键蛋白。脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜的主要组分之一，也被称为内毒素，它不仅有助于细菌抵御恶劣的环境和外界的毒素(包括抗生素)，也是细菌感染导致炎症和人体天然免疫反应的原因之一。因而lptd对细菌的生理功能和毒力均具有关键作用，被认为是革兰氏阴性细菌存活的“命门”。目前，研究表明lptd具有极强的免疫保护性。同时，其抗体通过与细菌lptd结合，阻止lps转运，影响细菌外膜通透性，显著提高细菌对疏水性抗生素的敏感性。与ompu类似，lptd的氨基酸序列在至少23种弧菌中保守，因而该蛋白是极具发展前景的疫苗靶点。但由于lptd在外膜中的丰度较低，难以作为主要抗原诱发机体免疫反应。
4、同时，尽管当前人们已认识到以疫苗为核心的免疫防治是控治水产养殖业病害的必由之路，但因水产养殖动物病原菌种类繁杂、血清型多样，不可能对所有病原菌及其血清型逐一进行疫苗预防接种。因此，急需开发一种多血清型的弧菌疫苗。
技术实现思路
1、为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种高表达omput-lptdep联合抗原的弧菌基因工程活菌疫苗及其制备方法和应用。
2、因此，本专利技术一方面公开了一种弧菌基因工程活菌疫苗，所述疫苗含有能稳定表达omput-lptdep联合抗原基因的副溶血弧菌vp5，其中副溶血弧菌vp5为含高表达联合抗原omput-lptdep基因重组质粒的副溶血弧菌vp3。
3、优选地，本专利技术所述的高表达omput-lptdep联合抗原基因的重组质粒为pbbr1mcs-1-p-omput-lptdep；所述重组质粒pbbr1mcs-1-p-omput-lptdep包含ompu的启动子、omput基因和lptdep基因。
4、优选地，本专利技术所述ompu的启动子的核苷酸序列如如seq id no.1所示。
5、优选地，本专利技术所述omput基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6、优选地，本专利技术所述lptdep基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
7、再一方面，本专利技术还公开了一种所述的副溶血弧菌vp5在制备弧菌基因工程活菌疫苗中的应用。
8、本专利技术基于丰度高和具免疫保护性的ompu和具有强免疫保护性的lptd的抗原表位相偶联的联合抗原omput-lptdep来开发安全有效以及使用方便的新型重组活细菌疫苗，该重组细菌含有高效表达ompu蛋白和lptd抗原表位的重组质粒，且该菌具有良好的稳定性，连续传代50代均没有丢失重组质粒，同时对弧菌的正常生长无影响。
9、本专利技术的重组弧菌活疫苗通过浸泡免疫后对弧菌均有良好的免疫保护作用。因此，该疫苗可为水产养殖动物弧菌病的控制以及水产养殖业的健康发展提供良好的保障。
10、需要特别说明的是，本研究在构建高效表达联合抗原菌株时，发现以其他丰度较高的外膜蛋白(如ompk等)作为与lptdep抗原表位的偶联蛋白时，联合抗原表达量不够高，且其免疫后效果不佳；为此，本专利技术人筛选到ompu蛋白，且对ompu进行分析和筛选其与lptdep的偶联部位时，筛选到omput(ompu1-317氨基酸)，这不影响ompu的功能及其免疫原性，且与其偶联的lptdep分布在外膜的外表面，此时高表达的omput-lptdep具有良好的免疫原性，且构建到弧菌中稳定、目的蛋白表达量高，免疫后具有良好的免疫效果。同时，lptd蛋白在一开始的研究中因其分子量较大、蛋白疏水性高，ompu与完整lptd蛋白偶联后存在表达及免疫原性不够好的问题，为此，本专利技术人对lptd蛋白进行分析，从中筛选的四个抗原表位肽偶联后具有良好的免疫原性，且构建到弧菌中稳定、目的蛋白表达量高，免疫后具有良好的免疫效果。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种弧菌基因工程活菌疫苗，其特征在于，所述疫苗含有能稳定表达OmpUT-LptDEP联合抗原基因的副溶血弧菌VP5，其中副溶血弧菌VP5为包含高表达OmpUT-LptDEP联合抗原基因重组质粒的副溶血弧菌VP3。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的高表达OmpUT-LptDEP联合抗原基因的重组质粒为pBBR1MCS-1-p-ompUT-lptDEP；所述重组质粒pBBR1MCS-1-p-ompUT-lptDEP包含ompU的启动子、ompUT基因和lptDEP基因。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述ompU的启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
4.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述ompUT基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
5.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述lptDEP基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
6.一种如权利要求1所述的副溶血弧菌VP5在制备弧菌基因工程活菌疫苗中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种弧菌基因工程活菌疫苗，其特征在于，所述疫苗含有能稳定表达omput-lptdep联合抗原基因的副溶血弧菌vp5，其中副溶血弧菌vp5为包含高表达omput-lptdep联合抗原基因重组质粒的副溶血弧菌vp3。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的高表达omput-lptdep联合抗原基因的重组质粒为pbbr1mcs-1-p-omput-lptdep；所述重组质粒pbbr1mcs-1-p-omput-lptdep包含ompu的启动子、o...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。