一种α１－抗胰蛋白酶药物的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种α１－抗胰蛋白酶药物的制备方法，具体涉及从人血浆分离的组分ＩＶ－１中纯化α１－抗胰蛋白酶药物。本发明专利技术包括以下步骤：将组分ＩＶ－１溶于缓冲液中，加入ＰＥＧ，沉淀后提取上层清液，在对上层清液进行Ｓ／Ｄ法病毒灭活、阴离子交换层析得到α１－抗胰蛋白酶洗脱液，接着对获取的α１－抗胰蛋白酶洗脱液超滤、分子筛层析，收集活性峰值范围内的流出液，然后对流出液进行超滤、浓缩、ＤＶ２０纳米膜过滤，所得滤液经分装、冷冻干燥得到α１－抗胰蛋白酶成品。本发明专利技术操作简便，缩短了生产时间，提高了效率与收率，收率≥７０％，比活≥０．８，所得产品具有高纯度，纯度≥９５％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药
，特别是涉及一种a l-抗胰蛋白酶药物的制备方法。
技术介绍
a l-抗胰蛋白酶(a 1-AT)属于生物制品的范围，是利用血浆分离的废弃物即低温乙醇分离法所获得的组分IV为原料，采用生物学工艺或分离纯化技术制备的生物活性制剂，在医疗急救、肺病抢救以及某些特定疾病的预防和治疗上，有着其它药品不可替代的重要作用。 a 1-抗胰蛋白酶(a l-Antitrypsin， a 1-AT或AAT)主要是肝细胞和单核细胞产生的一种糖蛋白，分子量为52-54KD，PI值4.8，含有10% _12%糖，是人体内血清蛋白溶解酶(如胰蛋白酶)的主要抑制物。在醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳中泳动于a 1区带，是这一区带的主要组分。健康人血浆中平均含量为3. 75±0. 61mg/ml，含量随年龄而异，性别之间差异较小，体内半衰期约4-6天。在正常情况下，人体血循环中90%以上的弹性蛋白酶等与al-AT以l : 1的比例结合成复合物而失活，同时被网状内皮细胞清除，但在如肺炎症性疾病中，炎症部位的某些细胞就会大量释放弹性蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白水解酶，使蛋白酶-抗蛋白酶系统失衡，导致炎症的加剧。1963年瑞典Eriksson首先发现a 1_抗胰蛋白酶缺乏者极易发生肺气肿，其原因是蛋白酶抑制剂a l-AT缺乏，使蛋白酶活性升高，肺的结构蛋白特别是弹性蛋白被降解，而弹性蛋白是细胞外基质成分，其降解造成肺结构破坏，导致肺气肿。急性肺损伤时，由于大量的NE及胰蛋白酶等被释放，引起体内正常含量的al-AT的活性中心-蛋氨酸被氧自由基所氧化，使a l-AT失去对NE及胰蛋白酶的抑制作用，从而使蛋白酶-抗蛋白酶系统失衡，正常组织细胞受到损伤，炎症进一步扩散。用a 1-AT治疗肺和某些器官的急性炎症性疾病在国外临床已得到高度重视。 Gadek等应用两部沉淀过程制备临床应用的a l-AT浓縮制剂，a l-AT仅占浓縮制剂蛋白含量的5%。 Glaser等建立的独特的a 1_AT制备工艺，采用二硫苏糖醇处理结合硫酸铵沉淀，DEAE-纤维素层析，从Cohn's低温乙醇工艺的废弃组分IV_1中提纯出纯度70%的a 1-AT浓縮制剂。朱威等从Cohn组分IV中提纯a l-AT，将Cohn组分FIV抽提液经沉淀，超滤，离子交换及凝胶过滤后，提纯a 1-AT ;巴氏灭活病毒，并考察其效果。用免疫单扩散，双向交叉免疫电泳、SDS-PAGE及合成基质法检测a 1_AT蛋白活性，用区带扫描法测其纯度达90%以上。20世纪80年代中期，Coan等在a 1-AT的生产工艺中加入60°C 10h病毒灭活方法，结果发现经热处理后a l-AT的活性回收率在90X以上，从而使a l-AT浓縮制剂的工艺日益成熟。Chen等采用离子交换层析技术从Cohn's低温乙醇分离法提取的组分IV-1中分离得到纯化的al-AT浓縮制剂。国内曾有研制al-AT制剂的报道，也是利用低温乙醇法制备血浆蛋白制品过程中的组分IV-1为原料，经过聚乙二醇沉淀、离子交换及凝胶层析、病毒灭活、除菌过滤、分装冻干制成a l-AT制剂，但是收率较低，所得产品纯度与活性均不高，不具有工业化生产的条件。目前，al-AT用于抢救和治疗急性肺气肿及肝病等疾病供不应求，中国完全依赖进口 ，由于价格昂贵，很多病人得不到及时的治疗，延误了
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的问题，提供了一种从人血浆分离的组分IV-1中纯化安全有效的al-抗胰蛋白酶药物的制备方法。 其技术解决方案是 —种a 1-抗胰蛋白酶药物的制备方法，包括以下步骤 a选取组分IV-l溶于pH为8. 1 8. 5的0. 1M Tris+25mM NaCl缓冲液中，在2 l(TC溶解lh，然后升温至34 4(TC恒温60 80分钟，调整pH至6. 8，再降温至2 l(TC ，向缓冲液中加入PEG，调整pH至5 5. 2，搅拌20 40分钟，在2 8静置一段时间，沉淀后提取上层清液； b对上层清液依次进行S/D病毒灭活、阴离子交换层析，得到a 1-抗胰蛋白酶洗脱液； c对步骤b中所获取的a 1-抗胰蛋白酶洗脱液进行超滤得到滤液l，接着对滤液1进行分子筛层析，收集活性峰值范围内的流出液； d对步骤c中所获取的流出液进行超滤、浓縮得到浓縮液，选取适量浓縮液，配制pH为6. 6 7. 4的20mM磷酸缓冲液，接着进行DV20纳米膜过滤，得到滤液2，滤液2经分装、冷冻干燥得到al-抗胰蛋白酶成品。 上述步骤a中，所述PEG的分子量为4000，浓度为10%。 上述步骤b中，阴离子交换层析按以下步骤进行层析柱用pH为7. 0的0. 03MNaCl缓冲液平衡，然后将S/D病毒灭活后的上层清液以160cm/h的速度上柱，再用pH为4. 5 7. 0的0. 025 0. 05M NaCl-磷酸缓冲液洗涤，最后用pH为8. 0的0. 5M NaCl缓冲液洗脱。 上述步骤c中，所述分子筛层析步骤中的平衡过程，选用pH为7. 0的0. 05MTris-HCl缓冲液。 上述步骤d中，所述磷酸缓冲液还含有50mM氯化钠、2 5%甘露醇及保护剂，保护剂为糖、氨基酸、蛋白或其组合物。 上述步骤d中，超滤过程选用分子量为10KD的滤膜，然后对超滤所得滤液进行3倍浓縮，浓縮液中a 1-抗胰蛋白酶的浓度为20 40mg/ml。 本专利技术的有益技术效果是 1、采用血浆分离的废弃物，组分IV-1为原料，提取有高度治疗价值的a 1-抗胰蛋白酶，大大提高了宝贵的人血浆的综合利用能力，降低成本，提高了经济效益。 2、利用AKTA系统对目的蛋白纯化过程进行了分步洗脱和梯度洗脱的大量正交实验研究，最终确立了以离子交换为主的大规模蛋白提纯工艺，该工艺操作简便，縮短了生产时间，提高了效率与收率，收率^ 70%，比活> 0.8，所得产品具有高纯度，纯度^ 95%。 3、该提纯工艺中采用渗透压休克法，目的蛋白溶解在低渗缓冲溶液中，激活a 1-抗胰蛋白酶，以及后续步骤中调节蛋白溶解液pH为6. 8，以保证蛋白质的活性和稳定性。另外，采用冷冻干燥法防止高温条件下al-抗胰蛋白酶失活，确保获得的产品具有高活性。 4、采用两步病毒灭活工艺，即S/D法(有机溶剂与去污剂去除病毒的方法)与纳米膜过滤除病毒相结合的方法，同时纯化步骤中的PEG沉淀也有去除病毒的作用，确保了产品的安全性。具体实施例方式下面通过具体实施例来详细说明本专利技术，有必要指出的是，以下实施例只用于对本专利技术的进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制。 实施例1 本专利技术中选用常规工业化血浆蛋白纯化过程中的Cohn氏组分IV-1作为提取a l-抗胰蛋白酶的原料，将其溶于24倍体积的pH为8. 1的O. 1M Tris(三羟甲基氨基甲烷)+25mM NaCl缓冲液中，在1(TC溶解lh，升温，在4(TC加热60分钟，用以激活a 1-抗胰蛋白酶。然后调整溶液pH至6. 8，以保证a 1-抗胰蛋白酶的活性和稳定性，再将溶液冷却到10°C，向冷却后的溶液中加入分子量为4000，浓度为10%的聚乙二醇(PEG)，然后将其pH值调整到5. 2，搅拌40分钟，去除组分IV-1中杂蛋白及病毒，在『C静置一段时间，使之充分沉淀后提取出上层清液。由于PEG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α１－抗胰蛋白酶药物的制备方法，其特征是包括以下步骤：　　ａ选取组分Ⅳ－１溶于ｐＨ为８．１～８．５的０．１ＭＴｒｉｓ＋２５ｍＭＮａＣｌ缓冲液中，在２～１０℃溶解１ｈ，然后升温至３４～４０℃恒温６０～８０分钟，调整ｐＨ至６．８，再降温至２～１０℃，向缓冲液中加入ＰＥＧ，调整ｐＨ至５～５．２，搅拌２０～４０分钟，在２～８℃静置一段时间，沉淀后提取上层清液；　　ｂ对上层清液依次进行Ｓ／Ｄ病毒灭活、阴离子交换层析，得到α１－抗胰蛋白酶洗脱液；　　ｃ对步骤ｂ中所获取的α１－抗胰蛋白酶洗脱液进行超滤得到滤液１，接着对滤液１进行分子筛层析，收集活性峰值范围内的流出液；　　ｄ对步骤ｃ中所获取的流出液进行超滤、浓缩得到浓缩液，选取适量浓缩液，配制ｐＨ为６．６～７．４的２０ｍＭ磷酸缓冲液，接着进行ＤＶ２０纳米膜过滤，得到滤液２，滤液２经分装、冷冻干燥得到α１－抗胰蛋白酶成品。

【技术特征摘要】
一种α1-抗胰蛋白酶药物的制备方法，其特征是包括以下步骤a选取组分IV-1溶于pH为8.1～8.5的0.1MTris+25mMNaCl缓冲液中，在2～10℃溶解1h，然后升温至34～40℃恒温60～80分钟，调整pH至6.8，再降温至2～10℃，向缓冲液中加入PEG，调整pH至5～5.2，搅拌20～40分钟，在2～8℃静置一段时间，沉淀后提取上层清液；b对上层清液依次进行S/D病毒灭活、阴离子交换层析，得到α1-抗胰蛋白酶洗脱液；c对步骤b中所获取的α1-抗胰蛋白酶洗脱液进行超滤得到滤液1，接着对滤液1进行分子筛层析，收集活性峰值范围内的流出液；d对步骤c中所获取的流出液进行超滤、浓缩得到浓缩液，选取适量浓缩液，配制pH为6.6～7.4的20mM磷酸缓冲液，接着进行DV20纳米膜过滤，得到滤液2，滤液2经分装、冷冻干燥得到α1-抗胰蛋白酶成品。2. 根据权利要求l所述的一种al-抗胰蛋白酶药物的制备方法，其特征在于步骤a 中，所述PEG的分子量为4000，浓度为10%。3. 根据权利要求1或2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞广礼，马山，仲立军，邵玉娟，师秀梅，菅长勇，乔福锋，
申请(专利权)人：山东泰邦生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]