【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物，特别涉及检测高毒力肺炎克雷伯菌的方法。
技术介绍
1、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae，kp)是克雷伯菌属中的一种临床常见的革兰氏阴性杆菌，可引起社区及医院获得性感染，导致肺炎、肝脓肿、泌尿系统感染以及血流感染等多种感染性疾病。kp包括3个亚种：即肺炎亚种、鼻臭亚种和鼻硬结亚种，其中以肺炎亚种最为常见。肺炎亚种又分为2个不同的克隆组，即致病力较弱的普通毒力肺炎克雷伯菌，即经典肺克(classic klebsiellapneumoniae，ckp)和致病力强的高毒力肺炎克雷伯菌，即高毒肺克(hypervirulentklebsiellapneumoniae，hvkp)。
2、高毒力肺克常引起社区获得性感染，多发生在免疫健全人群中，因其较强的致病力使其致残及致死率更高。高毒力肺克最易引起肝脓肿，常同时或先后伴有远隔器官的共感染，如内源性眼内炎、血源性肺脓肿或脑脓肿等。
3、高毒力肺克通过“窃贼模式”(stealth strategy)逃离人体细胞免疫，在巨噬细胞和中性粒细胞内可以生存。由于具有迁徙性，容易引起多器官症状，严重者甚至危及生命。
4、目前临床微生物实验室难以区分传统ckp和hvkp，这也阻碍了早期精准抗感染方案的及时实行。
5、高黏性是高毒力肺克最重要的特点之一。拉丝实验(string test)是目前鉴别高毒力肺克最常用的方法，具体方法为：使用接种环竖直向上轻轻蘸起血琼脂平板上的单个菌落，菌落拉丝长度≥5mm为拉丝试验阳性，提示
6、多位点序列分型和荚膜抗原血清型也曾被用于鉴别高毒力肺克，某些特殊的序列型(如st23、st65和st86)以及荚膜血清型(如k1和k2)与高毒力肺克密切相关，尤其是st23型与高毒力肺克所致肝脓肿明显相关，但这些基因型和血清型也可见于经典肺克。
7、随着分子生物学技术的进步，一些质粒上的特殊基因(如peg-344、irobcdn、iucabcd、iuta、prmpa、pks等)被认为是当前实验室鉴别高毒力肺克的最佳标志物。这些特异基因介导了铁载体和荚膜多糖产量的增加，从而提高了肺克的高黏性和毒力。
8、近年来，由于抗生素的革新换代和滥用，耐药菌株开始广泛出现，耐药问题的出现会直接加剧病原体的传播，高毒力和耐药的并行最终造成严重感染事件发生。因此需要建立简单、快速、灵敏检测高毒力肺炎克雷伯菌的方法，来提高安全预测预警水准和预防感染事件的发生。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了检测高毒力肺炎克雷伯菌的方法。本专利技术提供了β-甘露糖苷酶作为标志物在检测高毒力肺炎克雷伯菌中的应用。本专利技术采用一个全新的指标来检测高毒力肺克，跟传统鉴别高毒力肺克的拉丝试验相比，可靠性更高；跟使用分子生物学的方法检测特定的毒力基因相比，不需要昂贵的设备和对专业要求更高的技术人员，可操作性更强，普通实验室即可进行试验，而且成本大大降低。按照本专利技术的技术指标，可制成预制培养基或者检测试纸片，可随时对待测菌进行鉴别，使用方便。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了β-甘露糖苷酶作为标志物在检测高毒力肺炎克雷伯菌中的应用。
4、本专利技术还提供了β-甘露糖苷酶的底物在制备检测高毒力肺炎克雷伯菌的产品中的应用。
5、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述β-甘露糖苷酶底物标记有显色基团；所述β-甘露糖苷酶底物包括5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-吡喃甘露糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-d-吡喃甘露糖苷或6-氯-3-吲哚-β-d-吡喃甘露糖苷。
6、本专利技术还提供了高毒力肺炎克雷伯菌显色培养基，包括：
7、
8、所述高毒力肺炎克雷伯菌显色培养基的ph为7.3±0.4。
9、本专利技术还提供了高毒力肺炎克雷伯菌检测试纸，包括载体，显色基团标记的β-甘露糖苷酶底物，以及l-半胱氨酸盐酸盐、七水合硫酸镁或固紫b中的一种或多种。
10、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述载体的材质包含但不仅限于天然植物纤维、人造纤维或混合纤维。
11、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述β-甘露糖苷酶底物包含但不仅限于5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-吡喃甘露糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚-β-d-吡喃甘露糖苷或6-氯-3-吲哚-β-d-吡喃甘露糖苷。
12、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述高毒力肺炎克雷伯菌检测试纸的制备方法包括：取l-半胱氨酸盐酸盐、七水合硫酸镁溶于缓冲液中，和含有显色基团标记的β-甘露糖苷酶底物、固紫b的无水乙醇溶液混合获得包被液，将所述包被液和所述载体混合，干燥，获得所述高毒力肺炎克雷伯菌检测试纸。
13、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述包被液中l-半胱氨酸盐酸盐的浓度包括：0.25-1.5mg/ml、七水合硫酸镁的浓度包括：0.615-4.92mg/ml、显色基团标记的β-d-吡喃甘露糖苷的浓度包括：0.1～2mg/ml、固紫b的浓度包括：18.5-147μg/ml。
14、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述包被液的用量包括35.4μl/cm2载体面积。
15、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述载体的材质包含但不仅限于天然植物纤维，人造纤维以及混合纤维等。
16、本专利技术还提供了检测高毒力肺炎克雷伯菌的方法，包括基于如下任意项检测所述高毒力肺炎克雷伯菌：
17、(i)、β-甘露糖苷酶；和/或
18、(ii)、利用显色基团标记的β-甘露糖苷酶底物；所述β-甘露糖苷酶底物包含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-吡喃甘露糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-d-吡喃甘露糖苷或6-氯-3-吲哚-β-d-吡喃甘露糖苷；和/或
19、(iii)、所述高毒力肺炎克雷伯菌显色培养基；和/或
20、(iv)、所述高毒力肺炎克雷伯菌检测试纸。
21、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法包括：取β-甘露糖苷酶的底物于培养基中，培养待测肺炎克雷伯菌，若菌落显色，则判定待测肺炎克雷伯菌为高毒力肺炎克雷伯菌；若不显色，则判定为经典肺炎克雷伯菌；
22、所述β-甘露糖苷酶的底物包括但不仅限于5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-吡喃甘露糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-d-吡喃甘露糖苷或6-氯-3-吲哚-β-d-吡喃甘露糖苷。
23、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述β-甘露糖苷酶底物采用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-吡喃甘露糖苷，则高毒力肺炎克雷伯菌菌落显蓝色；
24、所述β-甘露糖苷酶底物采用5-溴-6-氯-3-吲哚-β-d-吡喃甘露糖苷，则高毒力肺炎克雷伯菌菌落本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.β-甘露糖苷酶作为标志物在检测高毒力肺炎克雷伯菌中的应用。
2.β-甘露糖苷酶的底物在制备检测高毒力肺炎克雷伯菌的产品中的应用。
3.高毒力肺炎克雷伯菌显色培养基，其特征在于，包括：
4.高毒力肺炎克雷伯菌检测试纸，其特征在于，包括载体，显色基团标记的β-甘露糖苷酶底物，以及L-半胱氨酸盐酸盐、七水合硫酸镁或固紫B中的一种或多种。
5.检测高毒力肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，包括基于如下任意项检测所述高毒力肺炎克雷伯菌：
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括：取β-甘露糖苷酶的底物于培养基中，培养待测肺炎克雷伯菌，若菌落显色，则判定待测肺炎克雷伯菌为高毒力肺炎克雷伯菌；若不显色，则判定为经典肺炎克雷伯菌；
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，包括：取含有β-甘露糖苷酶底物的包被液于载体上并干燥，取待测肺炎克雷伯菌菌悬液于所述载体上，温育，若载体显色，则判定待测肺炎克雷伯菌为高毒力肺炎克雷伯菌；若不显色，则判定为经典肺炎克雷伯菌；
8.提高高毒力肺炎克雷伯菌检测准确性的方法，其
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括：将显色基团标记的β-甘露糖苷酶的底物加于培养基中，培养待测肺炎克雷伯菌，若菌落显色，则判定待测肺炎克雷伯菌为高毒力肺炎克雷伯菌；若不显色，则判定为经典肺炎克雷伯菌；
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，包括：取含有显色基团标记的β-甘露糖苷酶底物的包被液于载体上并干燥，取待测肺炎克雷伯菌菌悬液于所述载体上，温育，若载体变色，则判定待测肺炎克雷伯菌为高毒力肺炎克雷伯菌；若不显色，则判定为经典肺炎克雷伯菌；
...【技术特征摘要】
1.β-甘露糖苷酶作为标志物在检测高毒力肺炎克雷伯菌中的应用。
2.β-甘露糖苷酶的底物在制备检测高毒力肺炎克雷伯菌的产品中的应用。
3.高毒力肺炎克雷伯菌显色培养基，其特征在于，包括：
4.高毒力肺炎克雷伯菌检测试纸，其特征在于，包括载体，显色基团标记的β-甘露糖苷酶底物，以及l-半胱氨酸盐酸盐、七水合硫酸镁或固紫b中的一种或多种。
5.检测高毒力肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，包括基于如下任意项检测所述高毒力肺炎克雷伯菌：
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括：取β-甘露糖苷酶的底物于培养基中，培养待测肺炎克雷伯菌，若菌落显色，则判定待测肺炎克雷伯菌为高毒力肺炎克雷伯菌；若不显色，则判定为经典肺炎克雷伯菌；
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，包括：取含有β-甘露糖苷酶底...
【专利技术属性】
技术研发人员：王则宇，吴旭晓，杨咏康，张硕，张震，郭明月，杨红云，付光宇，李彬，吴学炜，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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