【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及干扰素刺激基因15(interferon-induced15kda protein，isg15)、ⅰ型干扰素受体(interferon alpha and beta receptor subunit1，ifnar1)和dna损伤诱导转录因子4(dna damage inducible transcript 4，ddit4)三基因敲除的猪肺泡巨噬细胞的构建方法及应用。
技术介绍
1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)感染引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，各年龄段的家猪均可感染，其临床表现和病理变化以及流行病学特点类似于急性猪瘟，以高热、呼吸障碍和全身性出血为主要特征，病程短，病死率高达100％，对养猪业危害大。asfv也是唯一已知的虫媒dna病毒，可通过节肢动物尤其是乳突钝缘蜱传播，持续感染的野猪和软蜱是家猪感染asf重要的传染源。由于缺乏有效的疫苗，预防主要依赖严格的边境和口岸检疫。而一旦暴发该病则只能采取紧急的根除和净化措施以彻底扑灭疫情，进而恢复生产，这不仅造成了巨大的经济损失，同时直接威胁食品安全、养猪业的发展和国际贸易。世界动物卫生组织(oie)将其列入法定报告的动物疫病，我国将其列为一类动物传染病。asfv的主要靶细胞是肺泡巨噬细胞和单核细胞。在体外，asfv可在猪原代细胞包括外周血单核细胞(pbml)、肺泡巨噬细胞(pam)和骨髓巨噬细胞(bmdm)等上增殖，也可以在传代
2、i型干扰素(type i interferons，ifns)是一类重要的免疫调节蛋白质，主要包括干扰素α(ifn-α)和干扰素β(ifn-β)。这些细胞因子在病毒感染及其他病原侵袭时发挥关键作用。它们能够由病毒感染的细胞及周围免疫细胞迅速产生，并通过多种机制来抑制病毒复制和传播。i型干扰素能够诱导表达多种抗病毒基因，这些基因产物具有抑制病毒复制及传播的功能。i型干扰素通过与细胞表面的干扰素受体结合来促进受感染细胞与周围未感染细胞之间的通讯，从而使未感染细胞进入一种抗病毒状态，提高整体组织对于病毒的抵抗力。
3、干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes，isgs)是一类在干扰素(interferon，ifn)信号传导过程中被激活的基因。这些基因在细胞受到病毒感染或者有病毒感染风险时被诱导表达，并参与多种抗病毒免疫反应。isgs编码的蛋白质可以直接抑制病毒复制和传播。例如，一些isgs会干扰病毒的核酸合成，阻止病毒基因组的复制。一些isgs会改变细胞表面的分子结构或分泌抗病毒因子，限制病毒在细胞间的传播。另外，某些isgs参与诱导受感染细胞的凋亡，从而阻止病毒的进一步扩散。总的来说，干扰素刺激基因在抗病毒免疫中扮演着至关重要的角色，通过多种机制帮助机体抵御病毒感染。
4、成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，crispr)和crispr相关蛋白9(crispr-associated protein 9，cas9)组成的crispr/cas9基因编辑系统可实现高度精确的基因编辑，通过准确识别靶点dna序列并引导cas9蛋白对其进行切割，从而实现基因的插入、删除或修饰。相比传统的基因编辑技术，crispr/cas9具有更高的编辑效率和速度。通过设计合适的引导rna，可以快速将cas9蛋白引导到目标dna序列，实现基因编辑，crispr/cas9技术已经在许多领域得到广泛应用，包括基因功能研究、疾病治疗、农业改良、生物医药研发等。crispr/cas9基因编辑系统主要由两部分组成：导向rna(guide rna，grna)和cas9蛋白。导向rna通过碱基配对，特异性识别目标dna序列，并引导cas9蛋白到达该位置。cas9蛋白是一种核酸酶，能够在导向rna的引导下对目标dna序列进行双链切割。具体而言，cas9核酸酶会在pam(protospaceradjacent motif，原型间隔区临近基序)序列识别之后，借助导向rna模板，精确地切割含有与grna互补序列的双链dna。这一切割引发细胞的dna修复机制，通过非同源末端连接(non-homologous end joining factor，nhej)或同源重组(homology directed repair，hdr)进行修复，从而实现基因插入、删除或编辑。
5、非洲猪瘟病毒的主要靶细胞是单核巨噬细胞，虽然猪原代肺泡巨噬细胞可以用于非洲猪瘟病毒的分离、增殖特性、致病性的研究。但是在缺少代表靶细胞的细胞系的情况下只能用猪原代细胞进行培养，这就意味着需要相当数量spf猪(无特定病原体)来进行非洲猪瘟病毒的培养。一方面来源于不同个体的原代细胞差异大，而且猪原代细胞的制备会造成病毒的生产成本高，限制了非洲猪瘟弱毒疫苗的开发，另一方面也限制了对非洲猪瘟病毒与宿主互作机制的研究。目前已有利用tert基因建立猪原代肺泡巨噬细胞永生化细胞系的报道，但在该细胞系上病毒的复制水平比较低，影响了对非洲猪瘟病毒的研究。
6、肺泡巨噬细胞本身对病毒感染具有很强的抵抗力，产生这种抵抗力的一部分原因是由于肺泡巨噬细胞本身表达内在的干扰素(ifn)刺激基因(isgs)。这种内在表达的isgs可保护巨噬细胞免受病毒感染。我们前期对永生化细胞系mpam进行了基因转录组分析，通过分析我们发现与干扰素刺激相关的抗病毒基因isg15和ddit4呈高表达。isg15全名为干扰素诱导基因15，属于泛素样蛋白家族的一员。isg15蛋白通过共价连接(isgylation)与其它蛋白质结合，参与免疫反应和抗病毒防御机制。ddit4全名为dna损伤诱导转录因子4，是重要的调节因子，能够保护细本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种采用CRISPR/Cas9技术对猪肺泡巨噬细胞系mPAM中的ISG15、IFNAR1和DDIT4基因敲除的方法，所述方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其中sgRNA的具体序列为：
3.一种利用权利要求1或2所述的方法制备获得的ISG15、IFNAR1和DDIT4三基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系。
4.如权利要求3所述的ISG15、IFNAR1和DDIT4三基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系在非洲猪瘟病毒增殖特性研究中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种采用crispr/cas9技术对猪肺泡巨噬细胞系mpam中的isg15、ifnar1和ddit4基因敲除的方法，所述方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其中sgrna的具体序列为：
3.一种利用...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘长龙，吕丽蕾，姜一峰，周艳君，高飞，罗画叶，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：
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