【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物基因工程与代谢工程应用领域，具体涉及一种利用甲醇生产红没药烯的重组巴斯德毕赤酵母及其构建方法和应用。
技术介绍
1、红没药烯是一种植物来源的倍半萜类化合物，因具有特殊的气味，同时又有消炎及抗氧化活性而广泛应用于化妆品、食品添加剂及医疗行业，具有极高的市场价值。此外，红没药烯也是一种潜在的柴油和喷气燃料的替代品(peralta-yahya et al.nat commun.,2011,2:483；beller et al.nat prod rep.,2015,32(10):1508-1526)。因此，目前的植物提取法远远无法满足市场需求，亟待开发新的生产工艺路线。
2、通过构建微生物细胞工厂，已经实现多种化学品的清洁高效生产。甲羟戊酸(mva)途径强化是目前提高萜类化合物合成的最主要策略。ro等通过强化mva途径限速步骤(thmgr)，结合竞争途径抑制及全局转录因子调控，将紫穗槐二烯的产量提高近35倍(roetal.nature,2006,440(7086):940-943)。westfall等通过mva途径的整体强化，以及限速步骤基因thmgr拷贝数的优化，使得青蒿酸的产量提高2倍，并大幅提高前体紫穗槐二烯的产量(westfall et al.pnas.,2012,109(3):e111-118.)。
3、同时目前，已成功鉴定出植物中红没药烯合成元件红没药烯合酶，并实现了微生物合成，产物主要为α-红没药烯(kim et al.metab.eng.,2017,44:325-336)。为了
4、底物是生物转化的另一重要元素，大多数研究都是基于葡萄糖为碳源，而发掘新的碳源种类，如甲醇等，可以在一定程度避免粮食危机。此外，合成气制甲醇大量消耗二氧化碳，特别是“液态阳光”路线(shih et al.joule,2018,2(10):1925-1949)，由二氧化碳直接加氢获得甲醇，可在一定程度缓解温室效应。生物转化路线以甲醇为原料，可在温和条件下生成复杂含氧化合物，有望实现化学品的绿色生产(gao et al.syn.bio.j.,2020,1(2):158-173)。
5、毕赤酵母天然利用甲醇合成倍半萜时，其萜类合成途径虽仍为mva途径，但以甲醇为碳源时，不同酶的强化对产量影响不同，因此利用甲醇为碳源，强化mva代谢途径，实现以甲醇为唯一碳源高效生产红没药烯还需进一步研究。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种利用甲醇生产红没药烯的重组巴斯德毕赤酵母及其构建方法和应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：
3、一种产红没药烯的重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，将来源于冷杉的红没药烯合酶基因agbis整合至毕赤酵母基因组，即获得重组菌株；其中，agbis按照毕赤酵母密码子偏好性进行优化，优化后的序列如seq id no：1所示的核苷酸序列。
4、或，在上述获得重组菌株中过表达羟甲基戊二酸单酰辅酶a还原酶kphmgr，法尼基焦磷酸合酶kpfpps，乙酰乙酰辅酶a转移酶kperg10，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合成酶kphmgs，甲羟戊酸激酶kpmk，磷酸甲羟戊酸激酶kppmk，cas蛋白，红没药烯合酶与法尼基焦磷酸合酶融合蛋白kpfpps(gggs)agbis，回补his4基因后进而获得重组菌株；
5、或，在毕赤酵母菌株过氧化物酶体中过表达来源于冷杉的基因agbis编码的红没药烯合酶、由基因hmgr编码的羟甲基戊二酸单酰辅酶a还原酶、由基因fpps编码的法尼基焦磷酸合酶、由基因erg10编码的乙酰乙酰辅酶a转移酶、由基因hmgs编码的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合成酶、由基因pmd编码的磷酸甲羟戊酸脱羧酶、由基因idi编码的ipp异构酶、由基因mk编码的甲羟戊酸激酶、由基因pmk编码的磷酸甲羟戊酸激酶、由基因agbis编码的红没药烯合酶与kpfpps编码的法尼基焦磷酸合酶融合蛋白、由基因efmvae编码的双功能乙酰基辅酶a硫醇酶、由基因efmvas编码的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合成酶，且回补his4基因。
6、所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母菌过表达毕赤酵母的基因kprad52所得菌株。
7、所述将来源于冷杉的agbis整合至巴斯德毕赤酵母基因组pnsi-4位点，使agbis基因过表达；
8、所述羟甲基戊二酸单酰辅酶a还原酶kphmgr为源于毕赤酵母的kphmgr整合至巴斯德毕赤酵母基因组pnsi-1位点，使kphmgr基因过表达；
9、所述法尼基焦磷酸合酶kpfpps为来源于毕赤酵母的kpfpps整合至巴斯德毕赤酵母基因组pnsi-2位点，使kpfpps基因过表达；
10、所述乙酰乙酰辅酶a转移酶kperg10为将来源于毕赤酵母的kperg10整合至巴斯德毕赤酵母基因组pnsi-10位点，使kperg10基因过表达；
11、所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合成酶kphmgs为来源于毕赤酵母的kphmgs整合至巴斯德毕赤酵母基因组pnsi-10位点，使kphmgs基因过表达；
12、所述甲羟戊酸激酶kpmk为来源于毕赤酵母的kpmk整合至巴斯德毕赤酵母基因组pnsi-6位点，使kpmk基因过表达；
13、所述磷酸甲羟戊酸激酶kppmk为来源于毕赤酵母的kppmk整合至巴斯德毕赤酵母基因组pnsi-6位点，使kppmk基因过表达；
14、所述cas蛋白整合至巴斯德毕赤酵母基因组pnsi-3位点，使cas9基因过表达；
15、所述红没药烯合酶与法尼基焦磷酸合酶融合蛋白kpfpps(gggs)agbis为将来源于冷杉的agbis与来源于毕赤酵母的kpfpps融合整合至巴斯德毕赤酵母基因组pnsi-9位点，使agbis与kpfpps基因融合过表达。
16、所述毕赤酵母菌株过氧化物酶体中过表达时，将来源于冷杉的agbis连接过氧化物酶体信号肽larf整合至巴斯德毕赤酵母基因组pnsi-4位点，使agbis基因在过氧化物酶体过表达；
17、将来源于毕赤酵母的kphmgr连接过本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产红没药烯的重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：将来源于冷杉的红没药烯合酶基因AgBIS整合至毕赤酵母基因组，即获得重组菌株；
2.按权利要求1所述的产红没药烯的重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母菌过表达毕赤酵母的基因KpRAD52所得菌株。
3.按权利要求1或2所述的产红没药烯的重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：
4.按权利要求1或2所述的产红没药烯的重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：
5.按权利要求4所述的产红没药烯的重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：
6.一种利用甲醇产红没药烯的重组巴斯德毕赤酵母菌株，其特征在于，所述菌株通过权利要求1所述的方法构建所得。
7.一种权利要求6所述菌株的应用，其特征在于：所述菌株在以甲醇为唯一碳源下发酵，合成红没药烯中的应用。
8.一种合成α-红没药烯的方法，其特征在于：将权利要求6所述菌株于以甲醇为唯一碳源的Delft基础培养基中进行发酵培养合成α-红没药烯。>...
【技术特征摘要】
1.一种产红没药烯的重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：将来源于冷杉的红没药烯合酶基因agbis整合至毕赤酵母基因组，即获得重组菌株；
2.按权利要求1所述的产红没药烯的重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母菌过表达毕赤酵母的基因kprad52所得菌株。
3.按权利要求1或2所述的产红没药烯的重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：
4.按权利要求1或2所述的产红没药烯的重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：周雍进，高琳惠，蔡鹏，姚伦，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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