【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种高热稳定性高活性氰酸酶突变体，编码所述氰酸酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，氰酸酶突变体催化剂的制备，以及在降解含氰化合物中的应用。
技术介绍
1、氰化物是一种有毒化合物，存在于各种自然和人为环境中。尽管其毒性高，但由于氰基的较强的金属络合力，被广泛应用于电镀、冶金和医药等领域，不可避免的产生含氰废水。例如在电镀行业中处理铅、银、铜等的过程中，会产生不同浓度、不同组成的氰化废水；医药行业有些项目需要氰化物进行分析检查，也会产生氰化废水。含氰废水的污染范围广，污染时间久，毒性大，是国际公认的难降解废水。目前可以应用生物法、物理法和化学法来去除或分解氰化物，其中生物法处理氰化物有很多优点，如：产物低毒，可进一步转化，微量高效等，生物法处理氰化物不仅能有效治理含氰废水，还可以减少资本投入，同时环境友好(olaya-abril,alfonso.,karolina.,rodríguez-caballero,gema.et al.(2024).bacterial tolerance and detoxification of cyanide,arsenic and heavy metals:holistic approaches applied to bioremediation of industrial complexwastes.microbial biotechnology.)。
2、氰酸酶(cyanase)简称cyn，无需任何辅酶和辅因子的
3、蛋白质工程中的理性设计是基于对目的蛋白的序列、结构、催化机制等酶学信息有一定的了解的前提下，借助各类生物信息学软件，预测不同位点的突变对于目的蛋白稳定性和催化性能等方面的影响。全质粒pcr法是目前应用最广泛的定点突变方法之一，具有操作简便、快速、高效等优点。shaimaa s.sobieh构建了含cyn基因的表达载体，转化到莱茵衣藻中，实现cyn基因的过表达(sobieh,shaimaa s.,abed el-gammal,rasha.,el-kheiretal.heterologous expression of cyanobacterial cyanase gene in microalga forbioremediation of cyanide pollution.biology,2022,11,1420)，与野生型相比，转基因型藻类对氰化物胁迫具有显著的抗性，显示出其修复较高浓度含氰废水的能力。
4、然而，现有技术中公开的氰酸酶主要关注的是其对氰酸盐的转化能力和活性，并没有关注氰酸酶对无机氰化物的降解能力。也未见利用基因工程的方法提高氰酸酶热稳定性和活性的报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的就是为了解决现有技术中缺少兼具热稳定性和活性的氰酸酶的现状而提供一种氰酸酶突变体、核酸、重组表达载体及其应用。
2、更具体地，本专利技术提供一种高热稳定性高活性氰酸酶突变体，编码所述氰酸酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，氰酸酶突变体催化剂的制备，以及在降解含氰化合物中的应用。
3、本专利技术针对氰酸酶热稳定性的问题，借助理性设计的方法选取酶的突变位点对其进行定点突变，并在提高热稳定性的同时进一步提高了氰酸酶的催化活性，尤其是首次提出了基于大肠肝菌e.coli k-12substr.mg1655来源氰酸酶的高热稳定性高活性氰酸酶突变体，所述氰酸酶多位点突变体对无机氰的催化活性高，为氰酸酶在含氰废水领域的应用奠定了基础。
4、本申请从ncbi数据库中报道的大肠肝菌e.coli k-12substr.mg1655基因组中获得编码氰酸酶(cyn)的基因序列，并将其克隆至大肠杆菌bl21(de3)中成功实现表达，同时通过分子改造，提高了其对氰化物(有机氰类如氰酸钾、无机氰类如氰化钾)的活性和热稳定性，其多位点突变体能同时水解氰酸盐和无机氰化物，扩大了氰酸酶在含氰废水降解中的应用范围。
5、本专利技术以表面氨基酸(gly-ala，lys-arg)替换和共识理论为指导思想，借助生物信息学软件getarea和consensus finder的辅助，获得了具有高热稳定性、高活性的氰酸酶突变体。
6、本专利技术先基于嗜热蛋白表面氨基酸具有gly替换为ala，lys替换为arg的原则，利用getarea软件找到cyn表面总共有4个gly和3个lys，并对其分别进行定点突变，获得了2个热稳定性有所提升的突变酶；再基于同源序列中保守氨基酸较非保守氨基酸更为稳定的原则，利用consensus finder软件对cyn进行多序列比对，筛选出阈值大于80％的氨基酸总共有3个，将其分别定点突变成相应的保守氨基酸后，获得了1个针对氰酸盐酶活和热稳定性有所提升的突变酶。
7、将上述三个位点的氨基酸组合突变之后，得到了热稳定性显著提升以及比活也有所提高的三位点突变体，提高了现有的cyn热稳定性，发现其同时具有降解氰酸盐和无机氰化物的能力，进一步提升了生物法降解含氰废水的水平。
8、本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
9、本专利技术的技术方案之一：提供一种高热稳定性高活性氰酸酶突变体，其是将如seqid no.1所示的氨基酸序列的第37位、第154位或第51位中的至少一位进行突变后所得的热稳定性和活性均高于如seq id no.1所示的氨基酸序列对应的氰酸酶cyn的突变体。
10、在本专利技术的一个实施方式中，所述第37位的甘氨酸突变为丙氨酸，所述第154位的赖氨酸突变为精氨酸，所述第51位的谷氨酰胺突变为组氨酸。
11、在本专利技术的一个实施方式中，所述高热稳定性高活性氰酸酶突变体是将如seq idno.1所示的氨基酸序列中的第37位的甘氨酸，第154位的赖氨酸，第51位的谷氨酰胺分别突变为丙氨酸、精氨酸、组氨酸后所得的突变体。
12、在本专利技术的一个实施方式中，所述高热稳定性高活性氰酸酶突变体，是大肠肝菌e.coli k-12substr.mg1655来源的氰酸酶cyn(其氨基酸序列如ncbi登录号np_414874.1所示，核苷酸序列如ncbi登录号nc_000913.3所示)进行定点突变，通过全质粒pcr技术对cy本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种氰酸酶突变体，其特征在于，其是将如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第37位、第154位或第51位中的至少一位进行突变后所得的热稳定性和活性均高于如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列对应的氰酸酶的突变体；
2.根据权利要求1所述的一种氰酸酶突变体，其特征在于，所述高热稳定性高活性氰酸酶突变体是将如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的第37位的甘氨酸，第154位的赖氨酸，第51位的谷氨酰胺分别突变为丙氨酸、精氨酸、组氨酸后所得的突变体。
3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸是编码如权利要求1或2所述氰酸酶突变体的核酸。
4.一种包含权利要求3所述核酸的重组表达载体。
5.一种包含权利要求3所述核酸或权利要求4所述重组表达载体的重组表达转化体。
6.一种重组氰酸酶突变体催化剂，其特征在于，所述的重组氰酸酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：
7.权利要求1或2所述重组氰酸酶突变体的获得方法，其特征在于，利用分离权利要求5所述重组表达转化体表达氰酸酶突变体。
8.权利要求1或2
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述含氰化合物为氰酸盐或无机氰化物。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用具体为使用权利要求1或2所述氰酸酶突变体或权利要求6所述重组氰酸酶突变体催化剂降解含氰化合物废水。
...【技术特征摘要】
1.一种氰酸酶突变体，其特征在于，其是将如seq id no.1所示的氨基酸序列的第37位、第154位或第51位中的至少一位进行突变后所得的热稳定性和活性均高于如seq idno.1所示的氨基酸序列对应的氰酸酶的突变体；
2.根据权利要求1所述的一种氰酸酶突变体，其特征在于，所述高热稳定性高活性氰酸酶突变体是将如seq id no.1所示的氨基酸序列中的第37位的甘氨酸，第154位的赖氨酸，第51位的谷氨酰胺分别突变为丙氨酸、精氨酸、组氨酸后所得的突变体。
3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸是编码如权利要求1或2所述氰酸酶突变体的核酸。
4.一种包含权利要求3所述核酸的重组表达载体。
5.一种包含权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐毅，丁媛媛，徐照，
申请(专利权)人：上海沪溶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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