【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种具有抗血小板凝集作用的功能性p2x1单克隆抗体的应用。
技术介绍
1、p2x1属于atp嘌呤能受体家族。p2x1存在于血小板、中性粒细胞、和巨噬细胞，也表达于平滑肌细胞以及一些肿瘤细胞。p2x1作为一种配体门控的膜钙离子通道介导相对较高的钙离子通透。在中性粒细胞中参与lps诱导的急性全身炎症，p2x1通过参与小静脉中性粒细胞的迁移，在lps诱导的致死性内毒素血症中发挥重要作用。p2x1参于细胞凋亡，通过增加细胞内钙离子浓度导致细胞程序性死亡。p2x1与atp结合介导神经元之间的突触传递以及神经元到平滑肌的突触传递，例如，它负责小动脉和输精管的交感血管收缩；小鼠研究表明，这种受体对正常的雄性生殖功能至关重要。血管中表达的p2x1受体可被atp与释放的交感神经递质去甲肾上腺素共同激活，导致平滑肌去极化和收缩。p2x1受体在急性冠状动脉综合征(acs)患者血小板中的表达及激活p2x1受体后导致血小板内钙离子浓度的增加,p2x1受体在acs发生时对血小板的功能具有调节作用。
2、综上所述p2x1受体具有广泛而重要的生理功能，研发p2x1受体的功能性抗体用于调节因p2x1受体靶点导致的异常生理功能具有重要意义。如通过p2x1受体对血小板的功能调节可以抑制acs发生或改善其症状。由此研发一种具有抗血小板凝集作用的功能性p2x1单克隆抗体具有重要的应用价值。制备功能性p2x1单克隆抗体必须制备具有天然空间结构和活性的人源p2x1蛋白作为免疫抗原，但是p2x1属干atp门控离子通道，由三个同源亚基组成
3、因此，制备具有天然空间结构和活性的人源p2x1蛋白是个难题。目前市面上的p2x1的抗体多以合成小段多肽为抗原免疫获得，仅能作为检测抗体，不可能具有生理功能活性。目前市面上未见功能性p2x1抗体，包括抗血小板凝集作用的功能性单克隆抗体。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种具有抗血小板凝集作用的功能性p2x1膜蛋白单克隆抗体的应用，通过具有天然空间结构和活性的人源p2x1蛋白作为免疫抗原，并采用活性抗原筛选，功能性验证成功制备了具有抗血小板凝集作用的功能性p2x1单克隆抗体。
2、具体技术方案如下：
3、一种功能性p2x1膜蛋白的单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
4、1)制备天然空间结构和活性的人源p2x1蛋白；
5、2)应用小鼠杂交瘤单克隆抗体制备技术制备获得有功能性的p2x1单克隆抗体；
6、其中步骤1)的具体操作方法为扩增收集高表达带小鼠igg fc段纯化标签的人源p2x1蛋白的hp2x1mfc.copgfp/293稳转细胞，于tris盐酸缓冲液中冰浴匀浆破碎，离心，去上清，称取膜碎片沉淀湿重，共收集膜碎片沉淀湿重不低于100克；加入tris盐酸缓冲液制备成膜悬液，在膜悬液中，按照固液比5g:100ml的比例加入苯乙烯-马来酸共聚物冻干粉，混合均匀；振荡离心，收集上清液并过0.45μm滤膜，过膜后的滤液过protein a柱，用pbs缓冲液洗柱之后，用2倍柱体积的ek酶切缓冲液进行柱平衡，最后加入等柱体积的ek酶切缓冲液，用ek酶室温震荡酶切12h；随后通过重力流穿柱，收集流穿液，用10kd的超滤管置换为pbs缓冲液，并浓缩100倍，获得可溶性的由苯乙烯-马来酸环扣的仍在膜脂质双分子层上的具有天然空间结构和活性的人源p2x1蛋白纳米颗粒。
7、进一步地，步骤2)的具体操作过程为将步骤1)制备的具有天然空间结构和活性的人源p2x1蛋白作为抗原，用quick antibody水溶性佐剂免疫balb/c小鼠；并将这种具有天然空间结构和活性的人源p2x1蛋白作为包被抗原，以抗小鼠igg f(ab)2的酶标羊抗作为二抗，用elisa法检测免疫小鼠的血清效价，要求血清稀释204800倍od值仍然大于等于1的免疫小鼠才能用于后续杂交瘤制备将血清效价达到要求的小鼠脾脏制备杂交瘤；同样将具有天然空间结构和活性的人源p2x1蛋白作为包被抗原，以抗小鼠igg f(ab)2的酶标羊抗作为二抗，用elisa法检筛选阳性克隆；以od值大于1的为阳性克隆，获得克隆体，采用半数优选的方式取od值较大几个，将其杂交瘤细胞培养液依次倍稀，用上述同样的elisa法测定，要求稀释200倍时od大于0.5的克隆为候选阳性克隆，以获得有功能性的p2x1单克隆抗体。
8、一种采用上述制备方法制备得到具有抗血小板凝集作用的功能性p2x1单克隆抗体的应用，包括如下步骤：将有功能性的p2x1单克隆抗体进行体外功能性验证筛选，通过血小板聚集实验，要求筛选出的克隆为抗血小板凝集作用较好的功能性p2x1单克隆抗体；而后测定p2x1单克隆抗体对血栓模型小鼠的生存率影响，选择1个功能最好的克隆。
9、进一步地，获得的1个有抗血小板凝集作用功能较好的p2x1单克隆抗体标注为p001，包括重链可变区三个互补决定区和轻链可变区三个互补决定区，p001克隆重链可变区包括氨基酸序列如下的三个互补决定区：
10、h-cdr1：dysmp，
11、h-cdr2：wintetgnptyagdfkg，
12、h-cdr3：ifygny；
13、p001克隆轻链可变区包括氨基酸序列如下的三个互补决定区：
14、l-cdr1：kssqslldsdgktyln，
15、l-cdr2：qvsklds，
16、l-cdr3：wqgthfpht。
17、进一步地，p001抗体的重链可变区的氨基酸序列为seq id no.1，核苷酸序列为seq id no.2，p001抗体的轻链可变区的氨基酸序列为seq id no.3，核苷酸序列为seq idno.4。
18、本专利技术的有益效果在于：
19、通过本专利技术制备得到抗血小板凝集作用的功能性p2x1单克隆抗体具有抗血小板凝集作用、抗血栓形成作用，本专利技术通过血小板聚集实验，筛选出的克隆实验组的血小板聚集率与模型组达到极其显著差异，p<0.0001，与正常组比没有差异，p>0.5，获得1个抗血小板聚集作用效果最好的克隆；通过对血栓模型小鼠影响的实验验证，具有显著抗lps+角叉菜胶诱导的小鼠血栓形成作用，使小鼠尾部血栓症状比模型组有明显减轻，血小板凝集率极显著下降，p<0.01，使小鼠血栓症状和血小板凝集率指标与正常组相当，无显著差异，p>0.05。
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1.一种具有抗血小板凝集作用的功能性P2X1单克隆抗体的应用，其特征在于所述功能性的P2X1单克隆抗体具有抗血小板凝集作用，用于制备预防和/或治疗血栓的产品中的应用，以改善血栓造成的凝血异常；
2.如权利要求1所述的一种具有抗血小板凝集作用的功能性P2X1单克隆抗体的应用，其特征在于，步骤2)的具体操作过程为将步骤1)制备的具有天然空间结构和活性的人源P2X1蛋白作为抗原，用Quick Antibody水溶性佐剂免疫Balb/c小鼠；并将这种具有天然空间结构和活性的人源P2X1蛋白作为包被抗原，以抗小鼠IgG F(ab)2的酶标羊抗作为二抗，用ELISA法检测免疫小鼠的血清效价，要求血清稀释204800倍OD值仍然大于等于1的免疫小鼠才能用于后续杂交瘤制备将血清效价达到要求的小鼠脾脏制备杂交瘤；同样将具有天然空间结构和活性的人源P2X1蛋白作为包被抗原，以抗小鼠IgG F(ab)2的酶标羊抗作为二抗，用ELISA法检筛选阳性克隆；以OD值大于1的为阳性克隆，获得克隆体，采用半数优选的方式取OD值较大几个，将其杂交瘤细胞培养液依次倍稀，用上述同样的ELISA法测定，要求
3.如权利要求1所述的一种具有抗血小板凝集作用的功能性P2X1单克隆抗体的应用，其特征在于，将制备的有功能性的P2X1单克隆抗体进行体外功能性验证筛选，通过血小板聚集实验，要求筛选出的克隆为抗血小板凝集作用较好的功能性P2X1单克隆抗体；而后测定P2X1单克隆抗体对血栓模型小鼠的生存率影响，选择1个功能最好的克隆。
4.如权利要求3所述的一种具有抗血小板凝集作用的功能性P2X1单克隆抗体的应用，其特征在于，获得的1个功能较好的P2X1单克隆抗体标注为P001，包括重链可变区三个互补决定区和轻链可变区三个互补决定区，P001克隆重链可变区包括氨基酸序列如下的三个互补决定区：
5.如权利要求4所述的一种具有抗血小板凝集作用的功能性P2X1单克隆抗体的应用，其特征在于，P001抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核苷酸序列为SEQ IDNO.2，P001抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
...【技术特征摘要】
1.一种具有抗血小板凝集作用的功能性p2x1单克隆抗体的应用，其特征在于所述功能性的p2x1单克隆抗体具有抗血小板凝集作用，用于制备预防和/或治疗血栓的产品中的应用，以改善血栓造成的凝血异常；
2.如权利要求1所述的一种具有抗血小板凝集作用的功能性p2x1单克隆抗体的应用，其特征在于，步骤2)的具体操作过程为将步骤1)制备的具有天然空间结构和活性的人源p2x1蛋白作为抗原，用quick antibody水溶性佐剂免疫balb/c小鼠；并将这种具有天然空间结构和活性的人源p2x1蛋白作为包被抗原，以抗小鼠igg f(ab)2的酶标羊抗作为二抗，用elisa法检测免疫小鼠的血清效价，要求血清稀释204800倍od值仍然大于等于1的免疫小鼠才能用于后续杂交瘤制备将血清效价达到要求的小鼠脾脏制备杂交瘤；同样将具有天然空间结构和活性的人源p2x1蛋白作为包被抗原，以抗小鼠igg f(ab)2的酶标羊抗作为二抗，用elisa法检筛选阳性克隆；以od值大于1的为阳性克隆，获得克隆体，采用半数优选的方式取od值较大几个，将其杂交瘤细胞培养液依次倍稀，用上述同样的elisa法测定，要...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙辰晛，范春雷，周旭一，王超，
申请(专利权)人：杭州玖格生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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