【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酿酒酵母及基因工程，涉及过表达hal1酵母菌株及过表达hal1的应用。
技术介绍
1、伴随着能源短缺和环境污染日渐加剧，寻找有前景的可再生替代能源来取代传统的不可再生化石燃料势在必行。在此基础上，利用微生物发酵将生物资源转化为可再生燃料乙醇的设计思路备受青睐。二代燃料乙醇是由木质纤维素预处理后经微生物发酵获得，原材料具有来源广泛、成本低和绿色无污染的特点，生产的经济性和可持续性使二代燃料乙醇成为替代不可再生化石能源的理想选择。
2、木质纤维素原料包括玉米秸秆、杂草、甘蔗渣、木屑和其他农业残留物，因其在自然界中含量丰富、廉价和可再生的优势而具有极大的发展前景。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素、木质素和多种无机化合物构成，根据木质纤维素原材料来源的不同，每种化学组分的含量也存在差别。纤维素是以葡萄糖为单元的线性结晶聚合物，结构刚性且难以被破坏或利用，在以木质纤维素为底物进行微生物发酵时，此部分多通过酶解或化学方法转化为葡萄糖后才能被微生物利用。半纤维素是由 d-木糖、l-阿拉伯糖、d-葡萄糖等多种不同类型的单糖构成的异质多聚体。木质素则是一种三维聚合物分子，难以被微生物降解。由于木质纤维素结构复杂且不能直接被微生物利用，因此需要进行预处理，将其降解成小分子单糖后才能被吸收利用。葡萄糖和木糖是木质纤维素预处理产物中含量最高的两种单糖，分别占木质纤维素水解产物的60-70%和30-40%。葡萄糖可直接作为碳源用于微生物发酵生产，而能利用木糖的微生物却不多。所以，提高二代燃料乙醇生产效率的关键就在于挖掘能够赋予微
3、酿酒酵母是第一个完成全基因组测序的真核生物，具有遗传背景清晰、可操作性强、发酵性能好等特点，因而成为二代乙醇生产的常用菌株。针对酿酒酵母自身不能利用木糖的缺陷，研究人员通过引入高效的外源木糖代谢途径、调节代谢途径相关基因表达水平以优化代谢通路、改造木糖转运相关蛋白的性能等方式提高菌株的木糖利用能力。另外，有多项研究在改善酿酒酵母木糖利用能力的同时，对菌株的抑制物耐受性也进行了优化，如通过对转录因子、氧化还原及嘌呤代谢等途径中的关键基因进行遗传改造可显著提高菌株在抑制物胁迫下的发酵性能。当今的研究宗旨之一是利用基因工程、遗传驯化等手段对菌株的木糖发酵性能和抑制物耐受性进行改造，以此获得抑制物条件下能够高效利用木糖的酿酒酵母菌株，进而推动二代燃料乙醇行业的规模化、产业化发展。
技术实现思路
1、为解决二代燃料乙醇发酵过程中微生物木糖利用能力低、抑制物耐受性弱的问题，本专利技术公开一种过表达hal1酵母菌株及过表达hal1的应用，并证明hal1基因的过表达可显著提高酿酒酵母在有无乙酸胁迫下的木糖发酵性能。
2、为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
3、本申请首先构建了过表达hal1基因的载体，即重组质粒pjfe3-k-hal1，将构建成功的重组质粒转入大肠杆菌中，利用大肠杆菌增殖获得大量重组质粒，然后将重组载体转入bspc039菌株中，构建过表达hal1基因的bspc039-hal1菌株并进行了木糖发酵性能及乙酸胁迫下木糖发酵性能的检测。
4、具体内容如下：
5、本申请提供第一种应用，即基因序列如seq id no. 1所示的hal1在提高酿酒酵母bspc039木糖发酵性能中的应用。
6、本申请提供第二种应用，即基因序列如seq id no. 1所示的hal1在提高酿酒酵母bspc039乙酸胁迫下木糖发酵性能中的应用。
7、本申请提供第三种应用，即基因序列如seq id no. 1所示的hal1在优化木质纤维素乙醇生产酿酒酵母bspc039菌株性能中的应用。
8、上述应用均是通过过表达hal1实现，得到过表达hal1酵母菌株。
9、进一步，实现过表达hal1的载体为重组质粒pjfe3-k- hal1。
10、本申请提供一种过表达hal1酵母菌株，该菌株为酿酒酵母bspc039x-hal1菌株，所述菌株以酿酒酵母bspc039菌株基因组dna中的hal1基因构建重组质粒pjfe3-k-hal1，将所述重组质粒pjfe3-k-hal1和pjfe3-xi质粒转入酿酒酵母bspc039菌株中得到酿酒酵母bspc039x-hal1菌株，其中，所述hal1的基因序列如seq id no. 1所示。
11、具体的，过表达hal1酵母菌株的构建方法包括：
12、s01：以所述酿酒酵母bspc039菌株中的基因组dna为模板，利用引物hal1-a和引物hal1-b进行pcr扩增，得到hal1基因序列，其中，所述引物hal1-a和所述引物hal1-b的碱基序列如seq id no. 2和seq id no. 3所示。
13、以现有的酿酒酵母bspc039菌株基因组dna为模板，设计引物hal1-a和引物hal1-b。其中，酿酒酵母bspc039菌株由山东大学鲍晓明老师提供，具体可参考metabolicengineering14(2012)9–18。引物hal1-a和引物hal1-b的碱基序列分别如seq id no. 2和seq id no. 3所示，并在引物hal1-a 5’端添加bamh i核酸内切酶识别位点，在引物hal1-b3’端添加sal ⅰ核酸内切酶识别位点。具体的，引物hal1-a的碱基序列：5’-ctaagttttaattacaaagga tccatgcatttcaaagatttaggattgcatg-3’； 引物hal1-b的碱基序列：5’-aattcaatcctgcaggtcgactcaactattctgtgttgattgtctcc-3’。采用上述引物对目的片段进行pcr扩增，获得包含hal1基因的目的片段，其中，hal1基因序列如seq id no. 1所示。
14、s02：以pjfe3-k质粒为基因载体，利用bamh i核酸内切酶和sal ⅰ核酸内切酶连接所述hal1基因序列，得到重组质粒pjfe3-k-hal1。
15、pjfe3-k质粒携带kanmx4抗性标记基因和启动子tef1p，且包含多个核酸内切酶识别位点，本申请选用pjfe3-k质粒作为目的基因载体。具体的，先使用bamh i和sal ⅰ两个核酸内切酶对pjfe3-k质粒和pcr扩增获得的hal1基因片段分别进行酶切，利用dna连接酶将目的片段与载体连接。将连接后的重组质粒转入大肠杆菌ah109，使用引物hal1-c和引物hal1-d对转化后的大肠杆菌进行菌落pcr验证，由此获得构建成功的重组质粒pjfe3-k-hal1。其中，引物h本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基因序列如SEQ ID No. 1所示的HAL1在提高酿酒酵母BSPC039木糖发酵性能中的应用。
2.基因序列如SEQ ID No. 1所示的HAL1在提高酿酒酵母BSPC039乙酸胁迫下木糖发酵性能中的应用。
3.基因序列如SEQ ID No. 1所示的HAL1在优化木质纤维素乙醇生产酿酒酵母BSPC039菌株性能中的应用。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的应用，其特征在于，所述应用通过过表达HAL1实现，得到过表达HAL1酵母菌株。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，实现过表达HAL1的载体为重组质粒pJFE3-K- HAL1。
6.一种过表达HAL1酵母菌株，其特征在于，所述菌株为酿酒酵母BSPC039X-HAL1菌株，所述菌株以酿酒酵母BSPC039菌株基因组DNA中的HAL1基因构建重组质粒pJFE3-K-HAL1，将所述重组质粒pJFE3-K-HAL1和pJFE3-XI质粒转入酿酒酵母BSPC039菌株中得到酿酒酵母BSPC039X-HAL1菌株，其中，所述HAL1的基因序列如SEQ ID
7.根据权利要求6所述的过表达HAL1酵母菌株，其特征在于，所述过表达HAL1酵母菌株的构建方法包括：
...【技术特征摘要】
1.基因序列如seq id no. 1所示的hal1在提高酿酒酵母bspc039木糖发酵性能中的应用。
2.基因序列如seq id no. 1所示的hal1在提高酿酒酵母bspc039乙酸胁迫下木糖发酵性能中的应用。
3.基因序列如seq id no. 1所示的hal1在优化木质纤维素乙醇生产酿酒酵母bspc039菌株性能中的应用。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的应用，其特征在于，所述应用通过过表达hal1实现，得到过表达hal1酵母菌株。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，实现过表达hal1的...
【专利技术属性】
技术研发人员：何德云，张雪瑞，徐慧灵，鲍晓明，徐丽丽，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学山东省科学院，
类型：发明
国别省市：
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