【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测，具体涉及一种用于罗氏沼虾免疫效果评估的生物标志物、试剂盒及方法。
技术介绍
1、中国作为水产养殖大国，历年来一直大力推广的主推品种和主推技术中就包括了南美白对虾、蟹类、罗氏沼虾等经济甲壳类，虾蟹产业在水产养殖业中的比重也逐年越来越大。但是，在虾蟹产业快速发展的同时，虾蟹病害对于虾蟹养殖业的危害也逐步加大，特别是近年来，病害已成为影响全国虾蟹养殖发展的主要威胁。以罗氏沼虾为例，已发现mrtv、mrnv等多种病毒可以感染它，另外还有黑腮病、红体病、黑斑病、纤毛虫病、蜕皮障碍症等各种细菌病，造成养虾场的关闭、养虾相关产业的萧条及社会经济利益的锐减。而目前在虾蟹病害防治过程中，主要是大量使用抗菌素及一些化学药物，虽对有关疾病有一定疗效，一定程度上缓解了部分疾病的发生，但是抗生素频繁和大量使用，存在着耐药性、毒副作用大、虾蟹自身免疫力下降以及药物残留对人类健康造成诸多问题。由此，疫苗和免疫增强剂成为水产动物病害防治的首选，这其中疫苗对多种疾病尤其病毒性疾病有显著的预防作用，但特异性能力强，生产上操作可行性差，因而对提高甲壳类动物非特异性免疫能力有着独特功效的免疫增强剂，已成为水产养殖中的研究热点，同时也符合水产行业健康生态养殖这一新动向，如何合理利用免疫增强剂更是其中的研究重点。目前市场上虽然已逐步出现很多来源于植物、真菌、细菌等的免疫增强剂，但对甲壳类的非特异性免疫效果无法进行有效判定。
2、microrna是一类长度为21～24nt的非编码小rna，参与很多生物学信号通路调节。某些microrna的
3、当前罗氏沼虾养殖过程中，因为病害频发，病原种类繁多，导致特异性强的疫苗无法快速有效地被研发应用，而免疫增强剂具有免疫原广泛、成本较低的特点，是当前研究的重点。如何高效、快速地针对不同品种筛选出适宜的免疫增强剂仍是一个难题。
技术实现思路
1、针对上述现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种用于罗氏沼虾免疫效果评估的生物标志物、试剂盒及方法，以解决对现有的罗氏沼虾免疫增强剂的快速筛选评估问题。
2、为了解决上述问题，本专利技术采用了如下的技术方案：
3、一种用于罗氏沼虾免疫效果评估的生物标志物，所述生物标志物包括bta-mir-2478、mu-mir-3968和has-mir-7975。
4、一种用于罗氏沼虾免疫效果评估的试剂盒，所述试剂盒包括所述的生物标志物的引物。
5、进一步，所述引物的核苷酸序列为seq id no.1seq id no.3和seq idno.4。
6、进一步，所述试剂盒还包括mirna3’末端poly(a)尾修饰试剂和荧光定量pcr扩增检测试剂。
7、进一步，所述mirna3’末端poly(a)尾修饰试剂包括2.5体积份的10×pol y(a)polymerase buffer、1体积份的atp、0.5体积份的5u/μl的e.coli poly(a)polymerase、4体积份的poly(a)反应液、1体积份的10mm超纯dntps、3体积份的25μm rt primer、4体积份的5×rt buffer、0.5体积份的super rt reverse transcriptase和双蒸水。
8、进一步，所述荧光定量pcr扩增检测试剂包括25体积份的2×mirna qpcr premix(with sybr and rox)、1体积份的10μmforward primer、1体积份的10μm上游引物、1体积份的10μm下游引物和双蒸水。
9、一种用于罗氏沼虾免疫效果的(非疾病诊断目的)评估方法，包括：
10、对罗氏沼虾的mirna进行提取；
11、采用mirna3’末端poly(a)尾修饰法利用提取的罗氏沼虾的mirna进行mirnacdna第一链的合成；
12、利用合成的mirnacdna第一链采用荧光定量pcr进行检测；
13、评估罗氏沼虾bta-mir-2478、mu-mir-3968和has-mir-7975与免疫前的表达丰度。
14、进一步，所述采用mirna3’末端poly(a)尾修饰法利用提取的罗氏沼虾的mirna进行mirnacdna第一链的合成，包括：
15、(1)取2μg mirna，加入10×pol y(a)polymerase buffer 2.5μl、atp 1μl、5u/μl的e.coli poly(a)polymerase 0.5μl，采用rnase-free water补足至25μl，37℃孵育15min，得poly(a)反应液；
16、(2)向反应管中加入poly(a)反应液4μl、10mm超纯dntps 1μl、25μm rt primer 3μl、5×rt buffer 4μl、super rt reverse transcriptase 0.5μl和rnase-free water 7.5μl，42℃孵育50min；85℃孵育5min，得mirna第一链cdna。
17、进一步，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于罗氏沼虾免疫效果评估的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括bta-mir-2478、mu-mir-3968和has-mir-7975。
2.一种用于罗氏沼虾免疫效果评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的生物标志物的引物。
3.根据权利要求2所述的用于罗氏沼虾免疫效果评估的试剂盒，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
4.根据权利要求2所述的用于罗氏沼虾免疫效果评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括miRNA3’末端Poly(A)尾修饰试剂和荧光定量PCR扩增检测试剂。
5.根据权利要求3所述的用于罗氏沼虾免疫效果评估的试剂盒，其特征在于，所述miRNA3’末端Poly(A)尾修饰试剂包括2.5体积份的10×Pol y(A)Polymerase Buffer、1体积份的ATP、0.5体积份的5U/μl的E.coli Poly(A)Polymerase、4体积份的Poly(A)反应液、1体积份的10mM超纯dNTPs、3体积份的
6.根据权利要求3所述的用于罗氏沼虾免疫效果评估的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增检测试剂包括25体积份的2×miRNA qPCR premix(with SYBR and ROX)、1体积份的10μMForward primer、1体积份的10μM上游引物、1体积份的10μM下游引物和双蒸水。
7.一种用于罗氏沼虾免疫效果的评估方法，其特征在于，包括：
8.根据权利要求7所述的评估方法，其特征在于，所述采用miRNA3’末端Poly(A)尾修饰法利用提取的罗氏沼虾的miRNA进行miRNAcDNA第一链的合成，包括：
9.根据权利要求7所述的评估方法，其特征在于，所述利用合成的miRNA cDNA第一链采用荧光定量PCR进行检测的反应体系包括：2×miRNA qPCR premix(with SYBR and ROX)25μl，Forward primer(10μM)1μl，Reverse primer(10μM)1μl，miRNA第一链cDNA 3μl，采用RNase-Free Water补足至50μl；反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，进行40个循环。
10.权利要求2-6任一所述的用于罗氏沼虾免疫效果评估的试剂盒在制备罗氏沼虾免疫增强剂筛选试剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于罗氏沼虾免疫效果评估的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括bta-mir-2478、mu-mir-3968和has-mir-7975。
2.一种用于罗氏沼虾免疫效果评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的生物标志物的引物。
3.根据权利要求2所述的用于罗氏沼虾免疫效果评估的试剂盒，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为seq id no.1、seq id no.3和seq id no.4。
4.根据权利要求2所述的用于罗氏沼虾免疫效果评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括mirna3’末端poly(a)尾修饰试剂和荧光定量pcr扩增检测试剂。
5.根据权利要求3所述的用于罗氏沼虾免疫效果评估的试剂盒，其特征在于，所述mirna3’末端poly(a)尾修饰试剂包括2.5体积份的10×pol y(a)polymerase buffer、1体积份的atp、0.5体积份的5u/μl的e.coli poly(a)polymerase、4体积份的poly(a)反应液、1体积份的10mm超纯dntps、3体积份的25μm rt primer、4体积份的5×rt buffer、0.5体积份的super rt reverse transcriptase和双蒸水。
6.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：林锋，王志荣，张海琪，郝贵杰，黄爱霞，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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