【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开了一套可以将猪内源prdm1基因替换为mcherry的新型报告系统，属于生物。
技术介绍
1、在脊椎动物中，prdm1 是一种转录抑制因子，在祖细胞群中起着重要作用。在某些情况下，prdm1 调节祖细胞的分化，而在其他情况下，prdm1 是干性维持所必需的和决定pgc 的形成，可作为pgcs时期标志物。利用多能性干细胞体外诱导生成pgcs，可做为生成精子和卵子的材料，对进一步培育遗传改良新品种、保存地方新品种、以及人类异种器官移植体系的建立具有重大意义。但是，猪内源prdm1基因激活机制的研究还处于初级阶段，由于基因组不同位点的表观遗传差异，传统的异位报告系统尚不能真实地准确反映prdm1基因的表达水平。此外，内源prdm1的异常激活将导致下游基因表达谱的改变，影响机制研究的准确性。建立一套将猪内源prdm1基因表达替换为荧光信号的实时报告系统对后续的科学研究至关重要。由于猪源细胞基因编辑等基本技术体系的不成熟与对prdm1阳性细胞进行基因操作的难度较大，尚无相关的稳定可靠的报告系统被报道。本专利技术在已有基础上，建立了可以将猪内源prdm1替换为mcherry的新型载体系统。本专利技术提供了可以实时监测pgc诱导过程中内源prdm1基因激活程度的新方法，避免了prdm1基因激活带来的基因表达网络的改变。本专利技术具有创新性强、报告精确、安全性好、操作简便等特点。
技术实现思路
1、一、名词定义。
2、本专利所指prdm1（pr/set domain 1）
3、本专利所指mcherry是一种来自于蘑菇珊瑚（mushroom coral）的红色荧光蛋白，是一个由约237个氨基酸组成的蛋白质，从绿光使其激发，激发波长为532 nm并发出红色萤光，可以被荧光显微镜直接观测到，该蛋白对细胞状态几乎不产生其它影响。
4、本专利所指的报告系统，是基于crispr/cas9的基因编辑平台，构建的prdm1基因座定点编辑系统。该系统可以精确反应猪内源prdm1表达情况。包含一条可以特异性靶向prdm1翻译终止位点的sgrna和配套的将mcherry表达框通过同源重组的方式精确整合到猪内源prdm1终止密码子前的dna供体质粒。
5、二、构建可以将猪内源prdm1基因替换为mcherry的载体系统。
6、利用crispr/cas9技术对猪源细胞进行基因定向改造的基础上，研究了猪prdm1基因座的序列特征。在猪prdm1终止密码子taa附近设计特异性sgrna。
7、sgrna序列： 5-tgaaaatcttaaggatccat-3；
8、sgrna作用位点的序列： 5-tgaaaatcttaaggatccat-3；
9、依据crispr/cas9的工作特性，构建了含有两侧分别为896 bp和803 bp长度的同源臂的供体质粒（donor）。该供体质粒可以将位于两侧同源臂中间的mcherry-p2a-h2b-mcherry-sv40(ploya)-ef1-t2a-neor-wpre序列精确整合到猪内源prdm1的终止密码子之前，实现内源prdm1基因的替换。
10、三、构建将猪内源prdm1替换为mcherry的ips细胞株。
11、根据本专利技术前期构建的载体系统。我们构建了一株含有将猪内源prdm1替换成mcherry的ips细胞（ipscs）。
12、具体而言，通过干细胞转染试剂，将两个质粒导入猪ipscs中。转染1天后，在培养基中添加500 μg/ml的g418。培养7天后，挑取生长状态良好的单细胞克隆。通过提取细胞基因组，设计特异性引物做pcr鉴定，检测这些细胞的内源prdm1左右两侧的编辑情况。结果表明，这些细胞株均发生了我们所预期的编辑。选择状态最好的一株细胞扩增进行下一步实验，其余细胞被按照相关规定做销毁处理。
13、四、利用猪pgc诱导来验证该载体系统的功能。
14、为了验证本专利技术的工作能力，我们将上一步得到的将内源prdm1替换为mcherry的猪ipscs进行诱导pgc试验。实验结果表明，在猪pgc中出现了mcherry荧光，并且通过定量检测，相关pgc标志基因均上调。我们获得了可以将猪内源prdm1替换为mcherry的载体系统，这个载体系统可以很好的实时报告prdm1基因的表达，并可通过流式准确筛选出pgc。
15、五、将猪内源prdm1基因替换为mcherry的新型报告系统有以下优势。
16、专利技术创新性强，猪内源prdm1的激活会影响下游基因的表达，将猪内源prdm1通过crispr/cas9介导的基因编辑技术插入mcherry，在精确报告prdm1表达量的同时，避免因为prdm1激活而带来的细胞状态的改变。
17、从实际实验数据看，本专利技术可以实现prdm1基因的mcherry替换，对prdm1的表达指示效果明显。
18、本专利技术精确性强。技术方案上看，相比于传统的慢病毒启动子报告方案，本专利技术的mcherry与内源prdm1的表达水平相同，避免了多拷贝插入所带来的表达水平的波动。本专利技术在prdm1基因座的原位进行报告，避免了基因组不同位置带来的空间效应。
19、本专利技术操作简单，相比于传统的慢病毒侵染等途径繁琐的操作步骤，本专利技术只需要将目的质粒通过转染的方式导入细胞后即可进行报告系统整合阳性细胞的筛选。
20、本专利技术技术方案安全性良好，操作过程中不产生可能对人类健康产生危险的病毒毒液。
21、本专利文本中相关载体的构建、猪ipscs的使用和猪pgc诱导验证仅为本专利技术较佳的具体实施方式，本专利技术的保护范围不限于此，任何熟悉本
的技术人员在本专利技术披露的技术策略范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换，也应视为本专利技术的保护范围。
22、另外，本专利不存在知识产权纠纷。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.本专利技术提供了一种将猪内源PRDM1基因替换为mCherry的新型报告系统；其特征在于提供了一条能有效打靶猪PRDM1基因终止密码子的sgRNA序列如：SEQ ID 1所示，和配套的将猪内源PRDM1替换为mCherry的同源重组载体。
2.如权利要求1所述的配合上述sgRNA，将猪内源PRDM1替换为mCherry同源重组载体，其特征如下：
3.如权利要求1所述的利用，其特征在于使用与本专利相同的sgRNA核心序列，对猪PRDM1基因座进行改造，包括但不限于截短、加长等方式。
4.如权利要求1与权利要求2所述的利用，其特征在于以基因编辑技术，靶向猪PRDM1终止子位点附近，将PRDM1替换为不限于mCherry的其它蛋白来实现对PRDM1表达量的指示。
5.如权利要求1与权利要求2所述的利用，其特征在于将本专利技术开发为某种产品，包括但不限于PRDM1报告系统试剂盒。
6.如权利要求1与权利要求2所述的利用，其特征在于将本专利技术用于构建基因编辑细胞株的应用。
【技术特征摘要】
1.本发明提供了一种将猪内源prdm1基因替换为mcherry的新型报告系统；其特征在于提供了一条能有效打靶猪prdm1基因终止密码子的sgrna序列如：seq id 1所示，和配套的将猪内源prdm1替换为mcherry的同源重组载体。
2.如权利要求1所述的配合上述sgrna，将猪内源prdm1替换为mcherry同源重组载体，其特征如下：
3.如权利要求1所述的利用，其特征在于使用与本专利相同的sgrna核心序列，对猪prdm1基...
【专利技术属性】
技术研发人员：华进联，袁利明，吴晓龙，雷柞，李剑南，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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