【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及靶向cldn18.2的纳米抗体及其制备方法与用途。
技术介绍
1、紧密蛋白(claudin，cldn)是正常组织紧密连接中重要的一种蛋白质，具有4个跨膜结构域，其功能是参与细胞旁通透性和电导等过程的调节。claudin家族包含至少27个成员，其中claudin 18.2(cldn18.2)是claudin蛋白家族中的一员，它是一种具有高度组织表达特异性的跨膜蛋白，在正常组织中表达水平非常低，但在非恶性胃粘膜中高度选择性表达，与在邻近细胞表面表达的claudin 18.2-分子结合构成紧密连接复合体，形成选择性可渗透屏障，实现组织特异性渗透。这种紧密连接蛋白在恶性转化过程中会暴露在肿瘤细胞表面上，使其成为靶向癌症治疗的一个可接触的靶标。现有研究发现，在正常生理状态下，claudin 18.2仅在胃粘膜上已分化的上皮细胞中表达，而在其它的健康组织中均无表达。但在胃肠道肿瘤如胃癌、食管癌、胰腺癌、结直肠腺癌，以及肺癌、肝癌、肾癌、卵巢癌等多种肿瘤中，claudin18.2却呈现高表达的现象。肿瘤细胞极性的紊乱可导致细胞表面claudin18.2蛋白表位暴露，并出现异常激活。这一正常组织局限性表达而肿瘤中特异性高表达的特点使claudin 18.2成为了理想的实体瘤治疗靶点。目前有多款cldn18.2为靶点的药物进入临床阶段，单克隆抗体、adc、双特异性抗体和car-t疗法在cldn18.2阳性胃癌和胰腺癌人群中表现出了良好的安全性和有效性。虽然claudin 18.2在实体瘤靶向疗法开发领域具有潜力
2、发现和制备具有改进的亲和力和更强抗肿瘤活性的新型cldn18.2抗体，能进一步提高治疗效果，将cldn18.2靶向治疗的益处扩展到那些靶标表达水平较低的患者，具有广泛的临床应用价值。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一是提供一种亲和力高、特异性好的靶向cldn18.2的纳米抗体及其在肿瘤靶向治疗中的用途。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
2、为实现上述目的，本专利技术首先提供了靶向cldn18.2的纳米抗体，名称可为cldn18.2-vhh-223，所述纳米抗体包含氨基酸序列分别是seq id no.2的第26-33位的互补决定区cdr1、seq id no.2的第51-57位的互补决定区cdr2和seq id no.2的第95-109位的互补决定区cdr3。
3、所述纳米抗体(也称为单域抗体)只有重链抗体的可变区(vhh)，依次由框架区fr1、互补决定区cdr1、框架区fr2、互补决定区cdr2、框架区fr3、互补决定区cdr3和框架区fr4组成。
4、所述互补决定区(cdr)的序列根据kabat编号系统定义。
5、进一步地，所述纳米抗体的氨基酸序列可为下述任一种：
6、a1)seq id no.2，或与seq id no.2相比具有80％以上同一性的氨基酸序列，或与seq id no.2相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；
7、a2)在a1)的n端和/或c端连接标签或信号肽得到的氨基酸序列。
8、进一步地，所述置换可为保守置换。
9、进一步地，氨基酸序列的不一致处可在框架区(fr)，例如在框架区中具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加。
10、所述框架区(framework region，fr)为本领域已知的，是指可变区中除了cdr以外的区域，包括fr1、fr2、fr3和fr4。
11、所述几个可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
12、a2)中所述连接可通过肽键(peptide bond)直接连接，或通过接头连接。
13、a2)所示的纳米抗体可为融合了标签或信号肽且功能不变的纳米抗体。
14、为了使所述纳米抗体便于分离、纯化、检测和/或定位，可在所述纳米抗体的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
15、所述标签包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、trx(硫氧还蛋白)标签蛋白、氮利用底物a(nusa)标签蛋白、his标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha(流感血凝素)标签蛋白、myc标签蛋白、lacz标签蛋白、cbd(纤维素结合域)标签蛋白、噬菌体t7蛋白激酶(t7pk)标签蛋白、gfp(绿色荧光蛋白)、cfp(青色荧光蛋白)、yfp(黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。本领域技术人员已知如何根据期望目的选择合适的标签蛋白。标签的使用不改变目的蛋白(纳米抗体)的功能，其目的在于分离、纯化、检测或示踪，因此适用于本申请的标签蛋白并不局限于特定种类。标签可以通过本领域已知的化学裂解法或酶法(如引入蛋白酶切位点利用tev蛋白酶切割去除标签)与目的蛋白(纳米抗体)进行分离。
16、本专利技术还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
17、b1)编码所述纳米抗体cldn18.2-vhh-223的核酸分子；
18、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
19、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体；
20、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物；
21、b5)含有b1)所述核酸分子的重组宿主细胞。
22、所述生物材料均可表达所述纳米抗体cldn18.2-vhh-223。
23、进一步地，所述重组载体可为将编码所述纳米抗体cldn18.2-vhh-223的核酸分子(如seq id no.1所示的dna分子)克隆到表达载体中得到的重组表达载体。虽然本专利技术提供的实施例利用的表达载体是哺乳动物表达载体pcag-fc，但本专利技术不限于该特定载体。本领域技术人员可采用其它合适的载体，只要该载体能够克隆或表达编码所述纳米抗体cldn18.2-vhh-223的核酸分子即可。
24、进一步地，所述表达载体可选自原核表达载体(包括大肠杆菌(如bl21系列表达细胞、m15表达细胞、top10表达细胞和origamai系列表达细胞)表达载体但不限于此)和真核表达载体(包括酵母(如x33细胞、gs115细胞和smd1168细胞)表达载体、昆虫细胞(如sf21细胞、sf-9细胞和hi-5细胞)表达载体、哺乳动物细胞(如het293细胞和cho细胞)表达载体但不限于此)。
25、上述生物材料中，所述核酸分子可为下述任一种：
26、c1)编码序列或核苷酸序列是seq id no.1的dna分子；
27、c2)与seq id no.1限定的核苷酸序列具有75％以上同一性，且编码氨基酸序列是seq id no.2的纳米抗体的dna分本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.靶向CLDN18.2的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包含氨基酸序列分别是SEQID No.2的第26-33位的互补决定区CDR1、SEQ ID No.2的第51-57位的互补决定区CDR2和SEQ ID No.2的第95-109位的互补决定区CDR3。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列为下述任一种：
3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：
5.权利要求1或2所述的纳米抗体或权利要求3或4所述生物材料在下述任一项中的用途：
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肿瘤或Claudin 18.2靶点相关疾病为Claudin18.2阳性肿瘤。
7.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述的纳米抗体。
8.用于预防或治疗Claudin 18.2靶点相关疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1或2所述的纳米抗体或权利要求3或4所述的生物材料
9.权利要求1或2所述的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括在宿主细胞中表达权利要求1或2所述纳米抗体，并回收或分离所述纳米抗体。
10.检测Claudin 18.2蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1或2所述的纳米抗体或权利要求7所述的试剂盒检测Claudin 18.2蛋白。
...【技术特征摘要】
1.靶向cldn18.2的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包含氨基酸序列分别是seqid no.2的第26-33位的互补决定区cdr1、seq id no.2的第51-57位的互补决定区cdr2和seq id no.2的第95-109位的互补决定区cdr3。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列为下述任一种：
3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：
5.权利要求1或2所述的纳米抗体或权利要求3或4所述生物材料在下述任一项中的用途：
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肿瘤或clau...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨鑫，朱建高，杨文君，
申请(专利权)人：浙江康佰裕生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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