近拟鹿角灵芝种菌株或子实体特异分子标记及获得方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种Ganoderma subamboinense种菌株或子实体特异分子标记及 其获得方法与应用，该标记是PCR扩增后为461bp的特异DNA片断，其PCR扩增引 物对序列为5′tcgcgaagcgggctctttact 3′和5′ggtcataaagctgtccaaacg 3′；获得方法：1)菌 株或子实体基因组DNA的提取；2)获得特异DNA片段；3)获得特异PCR扩增引物； 4)用特异PCR扩增引物对对菌株或子实体的基因组DNA进行扩增；5)琼脂糖凝胶电泳 检测；应用：用于快速鉴定和检测Ganoderma subamboinense种菌株及市售灵芝类产品 的真伪。本发明专利技术的方法常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准 确性高的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属灵芝菌株鉴别领域，特别是涉及一种近拟鹿角灵芝(Gwoc/e，fl wkw6o/ewe J种菌株或子实体特异性分子标记及其获得方法与应用。 肖髓*据《神农本草经》和《本草纲目》记载，灵芝有益心气、养心生血、助心充脉、安神、 益脾益肺、强筋骨、利关节、治耳聋等功效。近代研究发现灵芝不但对人类三大死因的癌症、 脑溢血和心脏病有疗效，还对胃肠、肝脏、肾脏、白血病、神经衰弱、慢性支气管炎、哮喘、 过敏等疾病有显著疗效。此外灵芝还有强精、消炎、镇痛、抗菌、解毒、利尿、净血等多种 作用和功效。近年来，国际药学界发现灵芝所含有机锗是人参的4-5倍，锗被认为是长寿元 素，能促进血液循环，增强血红蛋白携氧能力，提高代谢功能、延缓衰老。因此，灵芝被 誉为健康食品之冠(虞和澍，1994)。周月琴等(2005)利用流式细胞仪检测发现Gao&nwaw6am6o^朋e乙醇提取物能明显 诱导HL-60细胞产生凋亡。陈春锋(2007)发现G..subamboinense也能显著促进巨噬细胞 Raw264.7吞噬中性红颗粒、释放NO,促进小鼠脾细胞的增殖；菌丝体多糖提取物的免疫活性 菌丝体多糖提取物与子实体多糖提取物一样表现出较强的激活巨噬细胞免疫活性作用。随着对灵芝的生物学功效的不断了解，以其为原料开发的产品越来越多，销售量也越来 越大，灵芝原料的质量越来越受到重视。近年来，随着灵芝各种产品的商品化，大大带动了 中国灵芝栽培生产的迅速发展，同时灵芝的种质资源也在不断扩大，但是由于我国食药用菌 品种登记制度尚未完善，因此灵芝的生产用菌种比较混乱，同种异名和异名同种的现象在栽 培生产上非常普遍，这不仅给菌种的管理带来了难度，也给以灵芝为原料的保健品及药品等 的相关产业造成了一定的经济损失。现在因为菌种问题常常造成我国灵芝产品质量难以稳定 的局面，也严重地制约了我国灵芝产品走出国门，走向国际市场的步伐。传统的分类鉴定主要依据子实体的形态学特征来进行，包括担孢子的大小和子实体真皮 菌丝的形态特征，但是子实体的许多形态学特征往往随着生长条件的不同而发生变化，而且 许多鉴别性特征经常是几个种所共有的，这给传统的分类学带来了很大的困难，仅仅依据形 态学特征进行菌种鉴定不是很可靠。因此，寻找可靠的鉴定手段，对灵芝产业的进一步发展 尤为重要。近年来，国内对栽培灵芝菌株的分类研究也越来越多，主要是集中在应用拮抗实验、5RAPD (Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA )分析及同工酶分析 技术方面。张松等(1995)通过对4株灵芝菌株的酯酶同工酶酶谱的分析发现，供试的四个菌株 存在5条相同的酶带，说明它们具有灵芝的某些共同的遗传特征，在其代谢过程中具有某 些相似的生理活动，但各菌株在酶带数目、Rf值及含量百分比上存在差异，均具有自己的 特征酶带，同时发现子实体形态学特征相似的，酯酶同工酶酶谱也相似，亲缘关系比较近， 这些说酯酶同工酶分析对于灵芝的分类鉴定有一定的价值。赵明文等(2003)利用RAPD技术对生产中常用的灵芝属8个菌株的亲缘关系进行了 分析。根据UPGMA构建的树状图将8个菌株在较低的相似水平上分成3个明显不同的组 第1乡且包括黑芝(Gflo^fer/wa tf/n/附)、松杉灵芝(Gawo^fe/vwa wgae)、 圆芝(Gawo<iCT7Wfl rart/wfi a/ww)、灵芝0770 (Gaoder附fl /wdc/ww 0770)禾卩卓韦国灵芝(Gawocfe vwaf /wc^wm HG); 第2组包括密纹灵芝(G0(ie 7na cre6raw〃'a,wm)禾口紫芝(Gaocfermar s7ne;we);第3纟且为 树舌灵芝(Gflo&r附aa;^/朋加ww)。这一结果与经典分类结果基本相符，表明RAPD技术 可以用来区分生产中一些常用的灵芝种，同时说明灵芝生产用种之间遗传差异较大，可能 是造成灵芝产品研究比较混乱的重要原因。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种 知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记 制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定 基础。随着分子生物学技术的快速发展，特别是分于标记和基因标记技术的建立与成熟，为 发展简便、快速、准确的鉴定技术提供了有效手段。SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)标记是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点，本发 明建立了Ganoderma subamboinense禾中的SCAR分子标记，能对Ganoderma subamboinense禾中 进行快速鉴定。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种Ganoderma subamboinense种菌株或子实体 特异性分子标记及其获得方法与应用，通过该分子标记能简便、快速、准确的鉴定和检 湖!l Ganoderma subamboinense菌禾中。本专利技术的Ganoderma subamboinense种菌株或子实体的特异分子标记，是一种基因SCAR分子标记，是PCR扩增后为461bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列 为5'tcgcgaagcgggctctttact 3'和5'ggtcataaagctgtccaaacg 3'。本专利技术的Ganoderma subamboinense种菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，包括如下步骤I. 菌株或子实体基因组DNA的提取(1) 菌株基因组DNA的提取将4-6。C的Ganoderma subamboinense菌种转接至!jPDA斜面上，26-28。C培养活化，5-7 天后转接到马铃薯葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基 因组DNA;(2) 子实体基因组DNA的提取将子实体l-2g剪碎，用体积比为1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTA Na2 混合物浸泡处理20-30小时，过滤，水冲洗，研磨粉碎后，加入800-1000pLpH8.0CNETS 溶液分装于2ml离心管中，60-70。C保温1-3小时，10000-12000g离心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子实体基因组DNA，其中的CNETS溶液组成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%(m/V)SDS;II. Ganoderma subamboinense种及灵芝属其他种的菌株或子实体ITS片段的获得、 测序及比对用ITS-PCR法，其中ITS引物对为ITS1F: 5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3，； ITS4: 5 '國TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，得Gcmoc^rma sw&am6o!ew种及灵芝属其他种的菌株或子实体ITS片段；然后测序并比对各个灵芝属种的代表性的序列。III. 特异性PCR引物的获得根据ITS序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　ｓｕｂａｍｂｏｉｎｅｎｓｅ种菌株或子实体的特异性分子标记，其特征在于：该标记是一种基因ＳＣＡＲ分子标记，是ＰＣＲ扩增后为４６１ｂｐ的特异ＤＮＡ片断，其ＰＣＲ扩增引物对序列为５′ｔｃｇｃｇａａｇｃｇｇｇｃｔｃｔｔｔａ ｃｔ　３′和５′ｇｇｔｃａｔａａａｇｃｔｇｔｃｃａａａｃｇ　３′。

【技术特征摘要】
1.一种Ganoderma subamboinense种菌株或子实体的特异性分子标记，其特征在于该标记是一种基因SCAR分子标记，是PCR扩增后为461bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列为5′tcgcgaagcgggctctttact 3′和5′ggtcataaagctgtccaaacg 3′。2. Ganoderma subamboinense种菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，包括步骤 I.菌株或子实体基因组DNA的提取(1) 菌株基因组DNA的提取将4-6。C的Ganoderma subamboinense菌种转接至!jPDA斜面上，26-28。C培养活化，5-7 天后转接到马铃薯葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基 因组DNA;(2) 子实体基因组DNA的提取将子实体l-2g剪碎，用体积比为1:2-3的95% V/V酒精和0.5 mol/L EDTA Na2混合 物浸泡处理20-30小时，过滤，水冲洗，研磨粉碎后，加入800-1000pL pH 8.0 CNETS溶 液分装于2ml离心管中，60-7(TC保温1-3小时，10000-12000g离心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子实体基因组DNA，其中的CNETS溶液组成是1% m/V CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%m/VSDS;II. Ganoderma subamboinense种及灵芝属其他种的菌株或子实体ITS片段的获得、 测序及序列比对用ITS-PCR法，其中ITS引物对为ITS1F: 5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'; ITS4: 5 '陽TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，得Ganoderma subamboinense种及灵芝属其他种的菌株或子实体ITS片段；然后测序并比对各个灵芝属种的代表性的序列。III. 特异性PCR引物的获得根据ITS序列的比对结果，找到Ganoderma subamboinense的ITS序列上特异性的结合 位点，利用Primer Premier5.0设计出特异性PCR引物对为5'tcgcgaagcgggctctttact 3'和 5'ggtcataaagctgtccaaacg 3';IV. 用特异PCR扩增引物对对Ganoderma subamboinense种菌株或子实体的基因组 DNA进行PCR扩增V. 琼脂糖凝胶电泳检测。3. 根据权利要求2所述的Ganoderma subamboinense种菌株或子实体的特异分子标记 的获得方法，其特征在于所述步骤I (l)中所述的LETS提取法①将冻干的菌丝大约20-30mg置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加入1000ml已配置好的LETS缓冲液，分装于2个1.5ml的离心管中；② 向每个管中加入600-800pL的苯酚:氯仿异:戊醇PCI比例为25:24:1上下 颠倒，充分混匀，4-10°C 16000g离心8-15分钟；③ 轻轻吸取上清于新的离心管中，加入500^L的PCI， 4°C 16000g离心8-15分钟；④ 重复步骤③，直到两相的界面没有杂质为止；⑤ 取上清，向上清液中加入2倍体积的已-2(TC预冷的无水乙醇或95^乙醇，轻轻混匀， 置于-2(TC冰箱中静置5-10分钟；⑥ 取出，4。Cl6000g离心10-15分钟；⑦ 倒去上清，再向管中加入50(^L预冷的70n/。V/V乙醇，用指头轻轻敲打沉淀使其溶 解，静置一会儿，4。C16000g离心IO分钟；⑧ 重复步骤⑦1次；⑨ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入适量体积的TE缓冲液pH8.0，按100mlTE缓冲液 加入2|iL lmg/ml...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐传红，张劲松，王晨光，苏春丽，唐庆九，贾薇，杨焱，刘艳芳，郝瑞霞，周帅，冯娜，刘方，
申请(专利权)人：唐传红，张劲松，王晨光，苏春丽，唐庆九，贾薇，杨焱，刘艳芳，郝瑞霞，周帅，冯娜，刘方，
类型：发明
国别省市：31