本发明专利技术提供了一种优化的脱氮假单胞菌发酵生产维生素Ｂ１２方法与合成培养基。所述的方法包括步骤：在适合发酵的且钾离子浓度为０．７－１．３ｇ／Ｌ发酵液下，培养生产维生素Ｂ１２的工程菌，发酵生产维生素Ｂ１２，其中所述的钾离子浓度以氯化钾计。本发明专利技术方法可大幅提高维生素Ｂ１２的产量，能更好地用于维生素Ｂ１２合成过程代谢流的通量分析。本发明专利技术还提供了相应的全合成培养基以及用所述全合成培养基生产维生素Ｂ１２的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及发酵领域，更具体地涉及一种优化的脱氮假单胞菌发酵生产维生素 B12方法以及相关的合成培养基。
技术介绍
维生素B^是一种结构非常复杂的分子，根据与其中心钴离子结合配基基团的不 同可形成羟钴胺素、甲基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素和氰钴胺素[1]。 维生素B12的化学结构如图9所示。 维生素B12是一种生物催化活性物质，是哺乳动物不可缺少的维生素，能够预防 和治疗恶性贫血症，维护神经系统的健康，促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢[2]; 现在国内和国外商品化的维生素B^几乎都是通过微生物发酵来生产的。能够 合成维生素B^的微生物根据其耗氧情况分为两类(l)厌氧菌或间性厌氧菌如费氏丙 酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)[3]、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)[4]和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimuri咖)等。(2)好氧菌比如脱氮假 单胞杆菌(Pseudomonasdenitrif icans)[5]，钴胺素根瘤菌[6] (Rhizobium cobalaminoge皿m FERM BP-4429)等。在这些微生物进行发酵生产时一般都是以麦芽糖、玉米浆和糖蜜为主要 原料，未见有在合成培养基中研究维生素B12发酵的报道。 为了能够最大限度的提高生产菌的合成能力，降低发酵生产成本，就必须从代谢 工程的角度来研究菌种在不同条件下的物质流走向，来优化代谢网络，使更多的底物流向 产物的合成[7]。为了能够对菌体的代谢网络模型了解和分析的更清楚,C同位素标记试验 来用于微生物代谢通量的研究日趋成熟，能够更准确地分析代谢通量的分布[8]。而这种开 展同位素示踪标记试验就必须要求人们对培养基中的碳源和氮源要特别清楚，只有这样才 能减少外围碳氮源对代谢同位素分布丰度的影响，减少实验误差。 目前，维生素B12需求量较大，因此提高维生素B12的表达水平成为当务之急，本 领域迫切需要开发高效的生产维生素B12的方法，尤其是能够在使用合成培养基下大幅度 提高维生素B12的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种高效的生产维生素B12的方法。 本专利技术的另一目的是提供可用于本专利技术高效的生产维生素B12的方法的合成培养基。在本专利技术的第一方面，提供了一种生产维生素B12的方法，它包括步骤 (a)在适合发酵的且钾离子浓度为0. 7-1. 3g/L发酵液的条件下下，培养生产维生素B12的工程菌，从而产生维生素B12，其中所述的钾离子浓度以氯化钾计；禾口 (b)从发酵液中分离纯化出维生素B12。 在另一优选例中，在步骤(a)中，按氯化钾计，钾离子的浓度为0.8-1. lg/L，更佳 地0. 9-1. 05g/L。 在另一优选例中，在步骤(a)中还包括控制培养基中葡萄糖浓度，使得葡萄糖浓 度为60-90g/L培养基。在另一优选例中，葡萄糖的浓度为65-80g/L，更佳地70-75g/L。 在另一优选例中，在步骤(a)中还包括控制磷酸氢二铵的浓度，使得磷酸氢二铵浓度为4. 0-8. Og/L发酵液。 在另一优选例中，磷酸氢二铵的浓度为5. 0-7. Og/L，更佳地5. 5_6. Og/L。 在另一优选例中，在步骤(a)中，还包括-控制发酵液中钾离子(按氯化钾计算)葡萄糖重量比为(0.7 1.3) : (60 90);或-控制发酵液中钾离子(按氯化钾计算)磷酸氢二铵二者的重量比宜为(0. 7 1. 3) : (4. 0 8. 0);或-控制发酵液中钾离子(按氯化钾计)葡萄糖磷酸氢二铵三者的重量比为(0. 7 1. 3) : (60 90) : (4. 0 8. 0)。 在另一优选例中，所述的工程菌是费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenr eichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrif icans)或钴胺素根瘤菌。 一种优选 的工程菌是脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrif icans)。 在本专利技术的第二方面，提供了一种可用于本专利技术上述方法的培养基，所述的培养基中钾离子(按氯化钾计)葡萄糖磷酸氢二铵三者的重量比为(o. 7 i. 3) : (60 90) : (4. 0 8. 0)。 在另一优选例中，所述的培养基的重量配方如下葡萄糖71.2±10% ;甜菜 碱9. 7±2% ;磷酸氢二铵5.6±1% ;硫酸铵5.9±1% ;尿素1.97±0. 5% ;硫酸镁1.38±0. 1% ;氯化钾0. 97±0. 1% ;DMBI(5，6-二甲基苯并咪唑):0. 077±0. 007 % ;硫酸亚铁0. 030±0. 01 % ;氯化钴0. 025±0. 01 % ;钼酸钠0. 020±0. 01 % ;和硫酸锌0. 020±0. 01%。 在本专利技术的第三方面，还提供了可溶性无机钾盐(包括氯化钾、磷酸钾、磷酸氢二 钾、磷酸二氢钾、乙酸钾、硫酸钾)等的用途，它们被用作发酵生产维生素B12的促进剂。 应理解，上述的以及本文下文中所详述的任二个或多个技术特征都可相互组合， 以构成新的技术方案。在此申请中，为了节省篇幅，不再一一列出。附图说明 图1当葡萄糖浓度为70g/L时，磷酸氢二铵和氯化钾含量的变化对VB12效价影响 的曲曲面图。 图2当磷酸氢二铵浓度为4g/L时，葡萄糖和氯化钾含量的变化对VB12效价影响 的曲曲面图。 图3当氯化钾浓度为0. 7g/L时，葡萄糖和磷酸氢二铵含量的变化对VB12效价影 响的曲曲面图。 图4显示了在5L罐中的发酵过程参数相关变化曲线。 图5显示了发酵过程的菌体形态(19小时)。 图6显示了发酵过程的菌体形态(39小时)。 图7显示了发酵过程的菌体形态(76小时)。 图8显示了发酵过程的菌体形态(110小时)。具体实施例方式本专利技术人通过深入而广泛的研究，意外地发现在维生素B12的发酵生产过程中， 通过控制钾离子浓度，可以大幅提高维生素B12的产量。在此基础上完成了本专利技术。 适用于本专利技术方法的表达维生素B12的菌株没有特别限制，可以是现有的生产维 生素B12的工程菌，也可用常规方法改造或诱变的工程菌。代表性的工程菌包括(但并不 限于)厌氧菌或间性厌氧菌如费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、 话:[氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)禾口鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium);以及好氧的脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrif icans)，钴胺素根瘤菌 [6] (Rhizobiumcobalaminoge皿m FERM BP-4429)等。 一种优选的工程菌是脱氮假单胞杆菌 (Pseudomonas denitrificans)。 在获得了表达维生素B12的工程菌后，便可在常规的适合表达维生素B12的条件下培养，以表达维生素B12。 钾离子浓度 在本专利技术中，通过控制发酵过程中的钾本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产维生素Ｂ１２的发酵方法，其特征在于，它包括步骤： （ａ）在适合发酵且钾离子浓度为０．７－１．３ｇ／Ｌ发酵液的条件下，培养生产维生素Ｂ１２的工程菌，从而产生维生素Ｂ１２，其中所述的钾离子浓度以氯化钾计；和 （ｂ）从发酵液中分离纯化出维生素Ｂ１２。
【技术特征摘要】
一种生产维生素B12的发酵方法，其特征在于，它包括步骤(a)在适合发酵且钾离子浓度为0.7-1.3g/L发酵液的条件下，培养生产维生素B12的工程菌，从而产生维生素B12，其中所述的钾离子浓度以氯化钾计；和(b)从发酵液中分离纯化出维生素B12。2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，按氯化钾计，钾离子的浓度为0. 8-1. lg/L，更佳地0. 9-1. 05g/L。3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中还包括控制培养基中葡萄糖 浓度，使得葡萄糖浓度为60-90g/L培养基。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，葡萄糖的浓度为65-80g/L，更佳地70-75g/L。5. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中还包括控制磷酸氢二铵的浓 度，使得磷酸氢二铵浓度为4. 0-8. 0g/L发酵液。6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，磷酸氢二铵的浓度为5. 0-7. 0g/L，更佳地 5. 5-6. 0g/L。7. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，还包括 -控制发酵液中钾离子(按氯化钾计算)葡萄糖重量比为(0.7 1.3) : (60 90);或-控制发酵液中钾离子(按氯化钾计算)磷酸氢二铵二者的重量比宜为(o.7 1. 3) : (4. 0 8. 0);或-控制发酵液中钾离子(按氯化钾计)葡萄糖磷酸氢二铵三者的重量比...
【专利技术属性】
技术研发人员：张嗣良，王泽建，王慧媛，张一鸣，储炬，庄英萍，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。