【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体及其编码基因、重组载体、重组基因工程菌和在制备l-甲硫氨酸中的应用，属于微生物代谢工程领域。
技术介绍
1、l-甲硫氨酸，又称为蛋氨酸，白色或黄色结晶,易溶于水、稀碱和稀酸,微溶于乙醇,不溶于乙醚。甲硫氨酸是一种含硫氨基酸，对人体来说是唯一的含硫必需氨基酸，是体内硫和甲基的主要来源，参与蛋白质的合成，能维持机体生长发育和氮平衡。同时也参与调节动物的新陈代谢，对动物来说是第一限制性氨基酸，缺乏时会降低饲料功效，限制动物生长。目前，l-甲硫氨酸已广泛用于饲料、医药、食品和化妆品等领域，其中尤以饲料工业中的需求量大。l-甲硫氨酸作为一种重要的氨基酸，其需求量呈现逐年上升的趋势。
2、l-甲硫氨酸的生产方法目前主要有化学法和生物法两种。但是利用化学合成生产成本较高，反应物多有毒性，比如丙烯醛、氨和氰化物等，反应复杂，副产物多，工业污染较严重。微生物发酵法其调控体系复杂，l-甲硫氨酸生物合成受到严格的反馈调节，难以实现工业化。“发酵-酶催化”偶联路线克服了传统发酵法中存在的问题，以葡萄糖为底物，发酵生产前体o-琥珀酰-l-高丝氨酸(osh)，进一步在o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶(metz)作用下与甲硫醇反应合成l-甲硫氨酸，原子经济性高、三废排放少，具有重要应用前景。
3、metz是一种依赖于吡哆醛的磷酸酶折叠ⅰ型，其结构可分为二聚体和四聚体，需要5′-磷酸吡哆醛(plp)作为辅因子，是l-甲硫氨酸合成过程中的关键酶，是l-甲硫氨酸的代谢途径中催化
技术实现思路
1、本专利技术提供一种o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体、编码基因、重组载体、重组基因工程菌以及在制备l-甲硫氨酸中的应用。通过分子改造技术，筛选新型高活性metz，以osh和甲硫醇钠为底物，应用于l-甲硫氨酸的高效合成。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、本专利技术提供一种重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体，所述突变体是将seq id no.2所示的氨基酸序列第47位、第125位和第366位进行单突变及组合突变获得的。
4、本专利技术通过基因挖掘技术筛选到一株来源于crenobacter luteus的o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶clmetz，并依据e.coli密码子偏好性进行密码子优化，以全基因合成的方法合成了核苷酸序列如seq id no.1所示的clmetz编码基因，其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。并通过蛋白质工程技术进行分子改造，对clmetz进行了定点饱和突变和组合突变，对获得的76株重组转化菌通过高通量筛选方法进行初步筛选后再经hplc分析方法复筛，将筛选得到的具有高酶活的r366n单突变菌株继续进行第125位gly位点的组合突变，经筛选得到10株酶活提高的突变株，其中，以第366位arg突变为asn，且第125位gly突变为glu的突变体具有最佳的活性和底物耐受性。本专利技术将筛选得到的具有高活性、高选择性的新型重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体作为催化剂应用于催化o-琥珀酰-l-高丝氨酸合成制备l-甲硫氨酸，并对催化反应体系进行了优化，精细调控了反应中的投料比以及反应条件，使得重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体在最优反应条件下具有高酶活并进一步提高了催化效率，在催化3h后产物l-甲硫氨酸的产率达到94.14％，实现了降本增效的目的，对推动生物催化制备l-甲硫氨酸的工业化应用具有重要意义。
5、作为优选，所述突变体是将seq id no.2所示的氨基酸序列第47位glu突变为asn、tyr、phe、ser中的一种，和/或第125位gly突变为asn、tyr、phe、glu中的一种，和/或第366位arg突变为asn、tyr、phe、glu中的一种获得的。
6、作为优选，所述突变体是将seq id no.2所示的氨基酸序列第125位gly突变为asn、tyr、phe、glu中的一种，且第366位arg突变为asn获得的。
7、作为优选，所述突变体是将seq id no.2所示的氨基酸序列第125位gly突变为glu，且第366位arg突变为asn获得的。
8、作为优选，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。由于氨基酸序列的特殊性，任何对seq id no.3所示氨基酸序列中的氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得的多肽片段或其变体，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本专利技术保护范围之列。
9、本专利技术还提供了上述的重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体的编码基因。作为优选，所述突变体的核苷酸序列如seq id no.4所示。任何对seq id no.4所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸序列具有90％以上的同源性，均属于本专利技术的保护范围。
10、本专利技术还提供了由所述重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体编码基因构建的重组载体。所述重组载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸。所述重组载体优选以质粒pet-28a为表达载体，并将所述的重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体的编码基因克隆至所述的质粒pet-28a。
11、本专利技术还提供了由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。具体而言，所述的重组基因工程菌通过以下方法制备得到：将所述的重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体编码基因整合到表达载体pet-28a中，构建了含有重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体编码基因的异源表达重组载体，再将重组载体转化至宿主菌中，获得含有重组载体的重组基因工程菌。其中，优选大肠杆菌e.coli bl21(de3)作为宿主菌。
12、本专利技术提供一种所述重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体在制备l-甲硫氨酸中的应用，所述应用包括：以含重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体编码基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体分离纯化的纯酶为酶源，以o-琥珀酰-l-高丝氨酸和甲硫醇钠为底物，以ph值5～10的缓冲溶液为反应介质构成反应体系，在25～40℃、150～600rpm条件下反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得l-甲硫氨酸。
13、作为优选，所述反应体系中，湿菌体的初始浓度为3～30g/l，o-琥珀酰-l-高丝氨酸的初始浓度为2～200g/l。
14、作为优选，所述反应体系中，按摩尔量计，o-琥珀酰-l-高丝氨酸与甲硫醇钠的投料比为1∶(1～3)。
15、作为优选，所述的重组o本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组O-琥珀酰-L-高丝氨酸巯基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第47位、第125位、第366位进行单突变或多点联合突变获得的。
2.如权利要求1所述重组O-琥珀酰-L-高丝氨酸巯基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第47位Glu突变为Asn、Tyr、Phe、Ser中的一种，和/或第125位Gly突变为Asn、Tyr、Phe、Glu中的一种，和/或第366位Arg突变为Asn、Tyr、Phe、Glu中的一种获得的。
3.如权利要求1所述重组O-琥珀酰-L-高丝氨酸巯基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第125位Gly突变为Asn、Tyr、Phe、Glu中的一种，且第366位Arg突变为Asn获得的。
4.如权利要求1所述重组O-琥珀酰-L-高丝氨酸巯基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第125位Gly突变为Glu，且第366位Arg突变为Asn获得的。
<...【技术特征摘要】
1.一种重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是将seq id no.2所示的氨基酸序列第47位、第125位、第366位进行单突变或多点联合突变获得的。
2.如权利要求1所述重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是将seq id no.2所示的氨基酸序列第47位glu突变为asn、tyr、phe、ser中的一种，和/或第125位gly突变为asn、tyr、phe、glu中的一种，和/或第366位arg突变为asn、tyr、phe、glu中的一种获得的。
3.如权利要求1所述重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是将seq id no.2所示的氨基酸序列第125位gly突变为asn、tyr、phe、glu中的一种，且第366位arg突变为asn获得的。
4.如权利要求1所述重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是将seq id no.2所示的氨基酸序列第125位gly突变为glu，且第...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，张晓健，李波，刘鹏，杨飞，赵雅名，王梦洋，郑裕国，
申请(专利权)人：杭州优泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。