【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及glcr-phoc操纵子转录抑制因子的突变体，其基因工程菌，以及在制备维生素b2中的应用。
技术介绍
1、核黄素(riboflavin)又称维生素b2，分子式为c17h20o6n4，是维生素b族中的一种水溶性维生素，在生物体内以黄素单核苷酸(fmn)和黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)两种形式存在，作为机体内一些重要的氧化还原酶的辅酶参与氧化还原反应，起到递氢的作用。核黄素的缺乏会导致生物体代谢发生障碍，但人和动物均不能自身合成，只能从食物中摄取，因此核黄素的生产在食品、饲料以及医药行业都具有非常广阔的市场。
2、目前核黄素的工业生产方法有植物萃取法、化学合成法、半合成法以及微生物合成法。其中，微生物合成法以其成本低、环境友好以及能源可再生等优点逐步占据主导地位，成为大部分工业化生产的主要方法。在众多可生产核黄素的微生物中，枯草芽孢杆菌(b.subtilis)作为一种非病原微生物，生理代谢及遗传背景清楚，便于确定代谢靶点及基因工程改造，并具有可靠的安全性，它们的发酵产物在食品与饲料业中已有长期的应用，对环境、医药和工业发酵生产都非常重要。其次枯草芽孢杆菌基因工程菌株能够过量合成叶酸、肌苷或鸟苷，具有为核黄素过量合成提供足够前体物的潜力，因此枯草芽孢杆菌基因工程菌在核黄素的微生物发酵生产中逐渐显示出了强大的生命力，成为主要生产菌株。
3、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)中核黄素的合成需要5-磷酸核酮糖(ru5p)和鸟嘌呤-5’-三磷酸(gtp)两个前体物质，其中ru5p来源于磷酸戊
4、glcr蛋白(glcr-phoc操纵子转录抑制因子)由glcr编码，参与磷酸转移酶系统表达的转录抑制，是deor家族的一个新的转录调节因子(ogura m,yamaguchi h,kobayashik,et al.whole-genome anakis of genes regulated by the bacillus subtiliscompetence transcription factor comk.[j].journal of bacteriology,2002,184(9):2344-2351)。glcr蛋白通过与pglcr核心元件结合抑制glcr-phoc操纵子的转录(lindner c,nijland r,van hartskamp m,et al.differential expression of two paralogousgenes of bacillus subtilis encoding single-stranded dnabinding ptein.[j].journal of bacteriology,2004,186(4):1097-1105)。有研究表明，glcr突变体表现为分解代谢操纵子的葡萄糖抑制缺失、葡萄糖转运不足和葡萄糖渗透酶基因的表达缺失(stülke j,martin-verstraete i,glas p,et al.characterization of ecose-repression-resistant mutants of bacillus subtilis:identification of the glcr gene.[j].archives of microbiology,2001,175(6):441-449)。枯草芽孢杆菌在糖进入细胞的过程中或之后磷酸化糖，细胞内磷酸糖向中心碳代谢产物转化的过程和磷酸糖的积累都会对细胞产生胁迫，当该过程中的酶缺失时会导致生长停滞和细胞增大(morabbi h k,manzoori,watzlawick h,et al.phosphosugar stress in bacillus subtilis:intracellularaccumulation of mannose 6-phosphate derepressed theglcr-phoc operon fromrepression by glcr.[j].journal of bacteriology,2019,201(9))。磷酸化过程及磷酸的转移效率，对于维生素b2合成的前体物质的积累和进一步转化至关重要。另外，调控基因glcr的转录表达水平，减少保内磷酸糖的积累可在一定程度上有助于菌株的生长，进而提高所需目标物的产量。目前，尚未有glcr-phoc操纵子转录抑制因子突变基因glcr用于维生素b2合成的报道。
技术实现思路
1、本专利技术人前期筛选出了一株高产维生素b2的枯草芽孢杆菌cgmcc no.16132菌株(见中国专利申请201910604170.3)，可发酵生产维生素b2。本专利技术作了进一步研究以发现对产维生素b2能力有影响的基因。经过研究发现一种glcr-phoc操纵子转录抑制因子编码基因的突变，通过验证在枯草芽孢杆菌中将glcr-phoc操纵子转录抑制因子编码基因点突变为所述突变基因则能够提高所述菌生产维生素b2的能力。
2、首先，本专利技术提供一种glcr-phoc操纵子转录抑制因子的突变体，其多肽氨基酸序列相对于参照如seq id no.3所示glcr-phoc操纵子的氨基酸序列而言存在下述突变：第78位的谷氨酸突变为甘氨酸。
3、优选地，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
4、其次，本专利技术提供所述的glcr-phoc操纵子转录抑制因子的突变体的编码基因。
5、优选地，所述核苷酸序列如seq id no.2所示。
6、相应地，本专利技术第三方面还提供含有所述glcr-phoc操纵子转录抑制因子的突变体的编码基因的表达盒、重组载体。所述重组载体对出发载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。例如，所述载体包括但不限于质粒，噬菌体。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。
7、更优选地是重组表达载体，更优选原核重表达载体。最优选是适合于在枯草芽孢杆菌中进行表达的表达载体。
8、第四方面，本专利技术提供含有所述glcr-phoc操纵子转录抑制因子的突变体的编码基因的重组宿主细胞。其中所述“宿主细胞”是具有本领域通常理解的含义，其能够导入本专利技术的突变体的编码基因的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。本专利技术的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选为原核细胞，更优选为枯草芽孢杆菌。
9、第五方面，本专利技术提供glcr-phoc操纵子转录抑制因子突变体或其编码基因、或所述重组载体、或所述重组宿主细胞在制备维生素b2中的应用。
10、第六方面，本专利技术提供一种增强枯草芽孢杆菌产维生素b2的方法，其是将染色体上的glcr-phoc操纵子转录抑制因子编码基因进行定点突变，获得产维生素b2的能力增强的枯草芽孢杆本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种glcR-phoC操纵子转录抑制因子的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列相对于参照如SEQ ID No.3所示glcR-phoC操纵子的氨基酸序列而言存在下述突变：第78位的谷氨酸突变为甘氨酸。
2. 如权利要求1所述的glcR-phoC操纵子转录抑制因子的突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.如权利要求1所述的glcR-phoC操纵子转录抑制因子的突变体的编码基因。
4. 如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
5.含有权利要求3所述的glcR-phoC操纵子转录抑制因子的突变体的编码基因的重组载体。
6.含有权利要求3所述的glcR-phoC操纵子转录抑制因子的突变体的编码基因的重组宿主细胞。
7.如权利要求1或2所述的glcR-phoC操纵子转录抑制因子的突变体或其编码基因、如权利要求5所述的重组载体或如权利要求6所述的重组宿主细胞在制备维生素B2中的应用。
8.一种增强枯草芽孢杆菌产维生素B2的方法，其特
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌BS168ribCm菌株作为出发菌株。
10.一种利用权利要求8或9所述的方法获得的枯草芽孢杆菌制备维生素B2的方法，其特征在于，包括培养所述枯草芽孢杆菌，以及收集维生素B2的步骤。
...【技术特征摘要】
1.一种glcr-phoc操纵子转录抑制因子的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列相对于参照如seq id no.3所示glcr-phoc操纵子的氨基酸序列而言存在下述突变：第78位的谷氨酸突变为甘氨酸。
2. 如权利要求1所述的glcr-phoc操纵子转录抑制因子的突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
3.如权利要求1所述的glcr-phoc操纵子转录抑制因子的突变体的编码基因。
4. 如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述核苷酸序列如seq id no.2所示。
5.含有权利要求3所述的glcr-phoc操纵子转录抑制因子的突变体的编码基因的重组载体。
6.含有权利要求3所述的glcr-phoc操纵子转录抑制因子的突变体的编...
【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，刘川，夏苗苗，杜广庆，房欢，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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