本发明专利技术涉及重组的具有稳定融合前构象的呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白、其编码核酸分子以及包含其的载体、组合物，还涉及上述蛋白、核酸分子、载体及组合物在制备疫苗、预防治疗用组合物中的用途。通过在RSV F引入一系列突变，获得了具有稳定融合前构象RSV F蛋白，所述突变位点不涉及任何非天然二硫键的引入，且不在重要的抗原表位附近及RSV F其它关键表位暴露表面引入任何突变，因此可以在稳定RSV F融合前构象的同时，尽可能把对RSV F的免疫原性及关键构象的影响降到最小，从而保证所设计抗原可稳定诱导产生对关键表位全面覆盖的中和抗体以阻止病毒入侵。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学领域，更为确切地涉及具有稳定融合前构象的重组呼吸道合胞病毒(rsv)f蛋白或相应的编码核酸分子及其用途，如用于疫苗免疫婴幼儿、老年人以及免疫力低下人群，这些人群在感染rsv后能引起严重呼吸道疾病。
技术介绍
1、呼吸道合胞病毒(rsv)是一种副粘病毒科肺病毒属、有包膜的rna病毒，其基因组为非分段单股负链rna。目前认为rsv病毒只有一种血清型，可分为a、b两种亚型。据世卫组织统计，全世界每年有约6400万rsv感染病例，其中160,000感染者死亡。rsv感染在早产儿、老年人和免疫力低下的人群中产生严重的临床症状。据报道，几乎所有儿童在两岁前都感染过rsv。rsv是引起2岁以下儿童严重下呼吸道疾病的主要病原体，其感染对于儿童特别是小于6个月的婴幼儿是严重威胁。同样，rsv感染可引起老年人、免疫力低下及有严重基础疾病人群的下呼吸道感染，其在这些人群中导致的死亡率与流感病毒感染相当。
2、rsv的rna基因组编码11种病毒蛋白，其中位于囊膜表面的粘附蛋白g和融合蛋白f是两个引起机体保护性免疫及中和抗体的主要抗原。rsv g蛋白在病毒侵染宿主细胞过程中起到粘附宿主细胞功能。g蛋白是rsv编码蛋白中最不保守的蛋白，其序列在不同rsv毒株中有较大差异。为了感染宿主细胞，rsv与其他包膜病毒(如流感病毒和hiv)一样，需要通过其编码蛋白介导病毒膜与宿主细胞膜融合来突破细胞膜屏障。rsv表面保守的融合蛋白f(rsv f蛋白)主要功能是在病毒侵染过程中介导病毒与宿主细胞膜融合，在病毒入侵宿主细胞过程中起不可被其它病毒蛋白替代的关键作用。不同亚型rsv表面f蛋白具有高度同源性。rsv f在机体中可诱导产生高滴度中和抗体。
3、与其它包膜病毒介导膜融合的表面糖蛋白(如流感病毒ha蛋白，冠状病毒s蛋白等)类似，rsv f在翻译后经一系列蛋白酶处理并折叠形成一种具有“融合前”构象的亚稳态三聚体，rsv f三聚体融合前与融合后构象及抗原表位情况如本专利技术说明书附图图1所示。在病毒进入细胞过程中，处于亚稳态融合前构象的f蛋白经历再折叠和构象变化，转变成更稳定的“融合后”构象。rsv f蛋白从融合前构象转变成融合后构象的过程不可逆转。一系列结构研究表明(mclellan js et al.science 340(6136):1113-7(2013)和mclellan js etal.science 342(6158):592-8(2013))，rsv-f融合前和融合后三聚体构象之间存在巨大的结构差异。而一系列关于f蛋白免疫相关性质的研究表明，具有融合前和融合后构象的rsvf蛋白在免疫原性上有很大的不同(calder,lj et al.virology 271,122-131(2000))，其中融合前rsv f具有更多关键性的中和抗体结合表位，如图2中所示的位于三聚体顶部附近的中和抗体结合抗原表位表位v。而只有一部分针对rsv-f融合后构象的抗体能够与病毒表面融合前刺突的天然构象发生交叉反应。如说明书附图2所示，重要的中和抗体结合抗原表位表位v只在具有融合前构象的rsv f中存在。重组rsv f蛋白研究表明其融合前构象很不稳定，绝大部分重组rsv f蛋白处于融合后构象。
4、目前还没有针对rsv感染的疫苗上市应用。辉瑞公司曾利用rsv灭活病毒进行了相关疫苗研制试验。但由于相关候选疫苗引起严重的感染增强现象而失败。rsv f蛋白是重要的候选亚单位疫苗抗原，且基于rsv f蛋白的免疫不会引起相关的感染增强现象，但基于rsv f蛋白的候选疫苗由于稳定性不高、纯度不足、再现性差、效力低等问题目前尚未取得突破性进展。目前针对rsv疫苗的研究集中于开发具有稳定融合前构象形式的rsv f蛋白或核酸疫苗(参见例如wo2010/1149745、wo2010/1149743、wo2009/1079796、wo2012/158613)，目前还未有被批准用于人类(特别是婴幼儿)的rsv f蛋白疫苗。
技术实现思路
1、除非特别指出，本专利技术中所提到rsv特指感染人的呼吸道合胞病毒。感染其它宿主的rsv病毒，会在rsv之前添加前缀指明，如牛rsv特指感染牛的rsv病毒。本专利技术中所描述的氨基酸可以是二十种天然存在的(或“标准”氨基酸)或其变体中的任何一种，例如d-氨基酸(具有手性中心的氨基酸的d-对映异构体)，或任何天然不存在于蛋白质中的变体，例如正亮氨酸。依据氨基酸所带电荷、亲水性或疏水性、大小和官能团，标准氨基酸可根据其性质分为几组。不同组中氨基酸的特性对于蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用很重要。一些氨基酸具有特殊性质，例如半胱氨酸，它可以与其他半胱氨酸残基形成共价二硫键(或二硫键)；带电荷的氨基酸如精氨酸，赖氨酸，天冬氨酸和谷氨酸，带正电荷的氨基酸残基之间可形成盐键稳定蛋白结构；脯氨酸诱导蛋白主链的转折；疏水氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸等在蛋白结构内部形成疏水核心稳定蛋白结构，其如暴露在蛋白结构外表面可能引起蛋白聚集；以及比其他氨基酸更灵活的甘氨酸，在多肽链中使得肽链柔性增加。在多肽链中的氨基酸统称为氨基酸残基，如多肽链中的亮氨酸称为亮氨酸残基。本申请通篇所提核苷酸序列是从5'到3'方向，并且氨基酸序列从n-末端到c-末端，为本领域的惯例。
2、呼吸道合胞病毒(rsv)的融合蛋白f在病毒侵染宿主细胞过程中介导病毒膜与宿主细胞膜的融合，是感染所必需的关键蛋白。rsv f mrna被翻译成一种名为f0的前体蛋白。f0多肽链含有574个氨基酸残基(seq id no：1)，其在n-末端有一段含有26个氨基酸残基的信号肽序列(seq id no：1中氨基酸残基1-26)，该信号肽被内质网中的信号肽酶去除。f0被细胞蛋白酶(特别是弗林蛋白酶)在两个位点(氨基酸残基109/110和136/137之间)(seq idno：1)切割，如说明书附图3所示，产生三个肽段，包括f1(seq id no：1中氨基酸残基137-574)、f2(seq id no：1中氨基酸残基27-109)和p27(seq id no：1中氨基酸残基110-136)。f1和f2两个肽段折叠产生两个结构域或亚基，指定为f1结构域和f2结构域。f1结构域(氨基酸残基137-574)在其n端包含疏水融合肽(seq id no：1中氨基酸残基137-153)，c端包含跨膜(tm)(seq id no：1中氨基酸残基530-550)和细胞质区域(seq id no：1中氨基酸残基551-574)。f1中紧临其n端疏水融合肽的肽段(氨基酸残基154至207，hra)及紧临其c端跨膜区域的肽段(氨基酸残基486至513，hrb)含有七肽重复序列。七肽重复序列是能形成卷曲螺旋结构的标志。如说明书附图1所示，已知在rsv f融合前构象中，f1和f2在空间上交织在一起，形成一个异源二聚体f1-f2，且f1与f2(seq id no：1中氨基酸残基27-109)之间通过两个二硫键(c69-c212,c37-c439)共价连接。三个f1-f2异源二聚体在病毒表本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组具有稳定融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，其包含在野生型RSV F蛋白中的F1和/或F2结构域中引入至少1个氨基酸残基突变的蛋白，且所述具有稳定融合前构象的呼吸道合胞体病毒F蛋白中不引入非天然二硫键。
2.根据权利要求1所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，其中所述融合前RSV F蛋白能够特异性结合识别RSV F融合前构象的特异性抗体。
3.根据权利要求2所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，所述识别RSV F融合前构象的特异性抗体为单克隆抗体D25。
4.根据权利要求1-3任一所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，其包含如下的1个或更多个氨基酸突变：
5.根据权利要求4所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，所述1个或更多个氨基酸突变包括：
6.根据权利要求4所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，所述RSV F蛋白包含选自如下的1个或更多个突变：
>7.根据权利要求4所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，所述RSV F蛋白包含如下突变：8.根据权利要求7所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，所述RSV F蛋白进一步包含：
9.根据权利要求4所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，所述RSV F蛋白包含如下的1个或更多个突变：
10.根据权利要求4所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白,其特征在于，所述RSV F蛋白包含如下突变：
11.根据权利要求10所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白,其特征在于，所述RSV F蛋白进一步包含：
12.根据权利要求6-11任一项所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白,其特征在于，其还包含如下一种或多种突变：
13.根据权利要求12所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白,其特征在于，所述突变为野生型RSV F蛋白的第254位氨基酸残基突变为天冬氨酸，和/或野生型RSV F蛋白的第92位氨基酸残基突变为丙氨酸或丝氨酸。
14.根据权利要求1-13任一项所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，其中所述F1结构域和/或F2结构域来自RSV A亚型毒株或RSV B亚型毒株。
15.根据权利要求1-14任一项所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，其中所述RSV F蛋白包含与F1结构域C末端连接的异源三聚化结构域，优选地，所述异源三聚化结构域选自如下的一种或更多种：
16.根据权利要求15所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒F(RSV)蛋白，其特征在于，其中所述RSV F蛋白包含与所述F1结构域C末端连接的以下任意一种异源多聚化结构域：
17.根据权利要求16所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，所述人工设计异源多聚化结构域为I53-50A&B，或能自组装形成纳米颗粒的DNA纳米材料。
18.根据权利要求16或17任一项所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，其中所述三聚化结构域或多聚化结构域与该RSV F蛋白的486-530位肽段之间任意氨基酸残基连接，优选地，所述连接通过肽段，优选地，所述肽段为GSGSGS。
19.根据根据权利要求1-18任一项所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，所述RSV F蛋白的氨基酸残基第106-136位被连接肽段取代，优选地，所述连接肽段为含氨基酸残基GS的连接肽段，更优选GS、GSGS、GSGSGS或GGSGSGSGS。
20.根据根据权利要求1-19任一项所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白，其特征在于，其为一种融合蛋白，其还包含异源蛋白，优选地，所述异源蛋白包括前导肽、标签蛋白和/或其它抗原表位蛋白。
21.一种重组核酸分子，其包含编码权利要求1-20中任一项所述融合前构象的呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白的核酸分子。
22.根据权利要求21所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子密码子经优化以用于在宿主细胞中表达；优选地，所述核酸分子密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达；更优选地，所述核酸分子密码子优化用于在灵长类动物细胞中表达；最优选的，所述核酸分子密码子优化用于在人类细胞中表达。<...
【技术特征摘要】
1.一种重组具有稳定融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，其包含在野生型rsv f蛋白中的f1和/或f2结构域中引入至少1个氨基酸残基突变的蛋白，且所述具有稳定融合前构象的呼吸道合胞体病毒f蛋白中不引入非天然二硫键。
2.根据权利要求1所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，其中所述融合前rsv f蛋白能够特异性结合识别rsv f融合前构象的特异性抗体。
3.根据权利要求2所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，所述识别rsv f融合前构象的特异性抗体为单克隆抗体d25。
4.根据权利要求1-3任一所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，其包含如下的1个或更多个氨基酸突变：
5.根据权利要求4所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，所述1个或更多个氨基酸突变包括：
6.根据权利要求4所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，所述rsv f蛋白包含选自如下的1个或更多个突变：
7.根据权利要求4所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，所述rsv f蛋白包含如下突变：
8.根据权利要求7所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，所述rsv f蛋白进一步包含：
9.根据权利要求4所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，所述rsv f蛋白包含如下的1个或更多个突变：
10.根据权利要求4所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白,其特征在于，所述rsv f蛋白包含如下突变：
11.根据权利要求10所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白,其特征在于，所述rsv f蛋白进一步包含：
12.根据权利要求6-11任一项所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白,其特征在于，其还包含如下一种或多种突变：
13.根据权利要求12所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白,其特征在于，所述突变为野生型rsv f蛋白的第254位氨基酸残基突变为天冬氨酸，和/或野生型rsv f蛋白的第92位氨基酸残基突变为丙氨酸或丝氨酸。
14.根据权利要求1-13任一项所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，其中所述f1结构域和/或f2结构域来自rsv a亚型毒株或rsv b亚型毒株。
15.根据权利要求1-14任一项所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，其中所述rsv f蛋白包含与f1结构域c末端连接的异源三聚化结构域，优选地，所述异源三聚化结构域选自如下的一种或更多种：
16.根据权利要求15所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒f(rsv)蛋白，其特征在于，其中所述rsv f蛋白包含与所述f1结构域c末端连接的以下任意一种异源多聚化结构域：
17.根据权利要求16所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，所述人工设计异源多聚化结构域为i53-50a&b，或能自组装形成纳米颗粒的dna纳米材料。
18.根据权利要求16或17任一项所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，其中所述三聚化结构域或多聚化结构域与该rsv f蛋白的486-530位肽段之间任意氨基酸残基连接，优选地，所述连接通过肽段，优选地，所述肽段为gsgsgs。
19.根据根据权利要求1-18任一项所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，所述rsv f蛋白的氨基酸残基第106-136位被连接肽段取代，优选地，所述连接肽段为含氨基酸残基gs的连接肽段，更优选gs、gsgs、gsgsgs或ggsgsgsgs。
20.根据根据权利要求1-19任一项所述的融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，其特征在于，其为一种融合蛋白，其还包含异源蛋白，优选地，所述异源蛋白包括前导肽、标签蛋白和/或其它抗原表位蛋白。
21.一种重组核酸分子，其包含编码权利要求1-20中任一项所述融合前构象的呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白的核酸分子。
22.根据权利要求21所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子密码子经优化以用于在宿主细胞中表达；优选地，所述核酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：向烨，孟思伟，毛思闳，徐翔，马丙婷，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：
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