【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，尤其涉及一种编码结核分枝杆菌磷酸二酯酶cnpb的基因、重组腺病毒及其应用。
技术介绍
1、结核病(tuberculosis，tb)是主要由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，mtb)经呼吸道感染引起的慢性传染病。2022年，全球新发结核病1060万人，死亡130万人，给人类的健康和公共卫生带来了巨大挑战。结核分枝杆菌为胞内寄生、且生长缓慢。抗结核药物难以彻底清除宿主胞内感染的细菌，且抗生素的广泛使用加剧了耐药结核的流行。治疗性疫苗主要通过增强宿主抗感染免疫，从而促进免疫清除结核分枝杆菌感染，作为结核病的辅助治疗或预防潜伏结核感染复发的策略已被多项研究证实有效(yadav,j.；verma,s.；chaudhary,d.；jaiwal,p.k.；jaiwal,r.,tuberculosis:currentstatus,diagnosis,treatment and development ofnovel vaccines.curr pharmbiotechnol 2019,20(6),446-458.)。目前多种候选治疗性疫苗已进入临床试验，显示出较好的应用前景。
2、结核分枝杆菌感染宿主后，可分泌细菌信号分子环二腺苷酸(c-di-amp)在宿主胞浆中，激活干扰素基因刺激蛋白(stimulator ofinterferon genes，sting)，诱导i型干扰素应答。然而，结核分枝杆菌已经进化出了一种免疫逃逸策略，通过磷酸二酯酶(phosphodiesterase
3、前期研究发现，大肠杆菌表达的重组cnpb通过皮下途径免疫小鼠，可诱导机体体液中抗原特异性的igg水平升高，肺泡灌洗液igg水平升高，但iga水平不高；肺部ifn-γ和il-10转录水平上调，而肺部cd4+、cd8+t细胞和b细胞的比例降低；cnpb免疫可减轻结核分枝杆菌攻击感染后肺组织病理损伤，并降低肺部荷菌数，使脾脏呈降低趋势(yanzhi l,huanhuann,jian k,et al.cyclic-di-amp phosphodiesterase elicits protectiveimmune responses against mycobacterium tuberculosis h37ra infection inmice.frontiers in cellular and infection microbiology,2022,12:871135)。表明，cnpb经皮下接种可提供一定的抗结核分枝杆菌感染保护作用，具有结核病疫苗候选抗原的潜能。需要注意的是，cnpb虽然可有效刺激系统性体液免疫应答，但是诱导细胞免疫应答有限，也不能诱导黏膜免疫应答。
4、结核分枝杆菌主要经呼吸道传播，呼吸道黏膜免疫是机体抗感染的第一道防线。采用皮下或皮内途径接种疫苗，主要诱导全身性的系统免疫应答，难以有效刺激黏膜局部的免疫应答。
5、腺病毒(adenovirus，ad)载体具有安全性好，转导效率高，宿主范围广，外源基因容载量大，免疫途径多样(如：肌肉、黏膜)，以及容易进行遗传操作等优点，因此被广泛用作疫苗载体。但是目前国内外尚无针对结核分枝杆菌磷酸二酯酶cnpb的重组腺病毒(recombinantad，rad)疫苗的研究。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种表达结核分枝杆菌磷酸二酯酶的重组腺病毒及其应用。本专利技术提供的重组腺病毒rad-cnpb在细胞和宿主体内表达cnpb蛋白，重组腺病毒rad-cnpb经黏膜接种能够有效刺激抗原特异性的黏膜免疫应答、体液和细胞免疫应答，具有良好的免疫原性。
2、本专利技术提供了一种编码结核分枝杆菌磷酸二酯酶cnpb的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3、本专利技术提供了一种重组腺病毒穿梭质粒pcadv-cnpb，包括初始腺病毒穿梭质粒和所述的结核分枝杆菌磷酸二酯酶cnpb的基因。
4、优选的，所述基因克隆于所述初始腺病毒穿梭质粒的eco ri和bam hi酶切位点之间。
5、本专利技术提供了一种重组腺病毒rad-cnpb，将所述的重组腺病毒穿梭质粒pcadv-cnpb与骨架质粒转染细胞，收集培养细胞上清，即可获得重组腺病毒rad-cnpb。
6、优选的，所述重组腺病毒rad-cnpb以复制缺陷型的人5型腺病毒为载体。
7、优选的，所述重组腺病毒rad-cnpb的滴度为(5～6)×1010pfu/ml。
8、本专利技术提供了所述的重组腺病毒rad-cnpb在制备预防和/或治疗结核病的疫苗中的应用。
9、优选的，所述疫苗为黏膜免疫疫苗。本专利技术还提供了所述的重组腺病毒rad-cnpb在制备预防和/或治疗结核病的生物制品中的应用。
10、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的编码结核分枝杆菌磷酸二酯酶cnpb的基因是根据真核宿主密码子使用偏好性、mrna二级结构、gc含量等参数进行密码子优化后获得的，优化后cnpb核苷酸序列与原核苷酸序列相似性为75％。本专利技术利用优化后的核苷酸编码序列制备了重组腺病毒穿梭质粒pcadv-cnpb以及重组腺病毒rad-cnpb。本专利技术制备的rad-cnpb具有免疫原性，无需添加佐剂，经呼吸道黏膜接种能够诱导显著的黏膜、体液和细胞免疫应答。本专利技术制备的重组腺病毒rad-cnpb疫苗在制备预防或治疗结核病的生物制品研制中具有较好的应用前景。
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1.一种编码结核分枝杆菌磷酸二酯酶CnpB的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种重组腺病毒穿梭质粒pcADV-CnpB，其特征在于，包括初始腺病毒穿梭质粒和权利要求1所述的结核分枝杆菌磷酸二酯酶CnpB的基因。
3.根据权利要求2所述的重组腺病毒载体穿梭质粒pcADV-CnpB，其特征在于，所述基因克隆于所述初始腺病毒穿梭质粒的Eco RI和Bam HI酶切位点之间。
4.一种重组腺病毒rAd-CnpB，其特征在于，将权利要求2或3所述的重组腺病毒穿梭质粒pcADV-CnpB与骨架质粒转染细胞，培养细胞收集细胞上清即可获得重组腺病毒rAd-CnpB。
5.根据权利要求4所述的重组腺病毒rAd-CnpB，其特征在于，所述重组腺病毒rAd-CnpB以复制缺陷型的人5型腺病毒为载体。
6.根据权利要求4或5所述的重组腺病毒rAd-CnpB，其特征在于，所述重组腺病毒rAd-CnpB的滴度为(5～6)×1010pfu/mL。
7.权利要求4～6任意一项所述的重组腺病毒rAd-
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述疫苗为黏膜免疫疫苗。
9.权利要求4～6任意一项所述的重组腺病毒rAd-CnpB在制备预防和/或治疗结核病的生物制品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种编码结核分枝杆菌磷酸二酯酶cnpb的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种重组腺病毒穿梭质粒pcadv-cnpb，其特征在于，包括初始腺病毒穿梭质粒和权利要求1所述的结核分枝杆菌磷酸二酯酶cnpb的基因。
3.根据权利要求2所述的重组腺病毒载体穿梭质粒pcadv-cnpb，其特征在于，所述基因克隆于所述初始腺病毒穿梭质粒的eco ri和bam hi酶切位点之间。
4.一种重组腺病毒rad-cnpb，其特征在于，将权利要求2或3所述的重组腺病毒穿梭质粒pcadv-cnpb与骨架质粒转染细胞，培养细胞收集细胞上清即可获得重组腺病毒rad...
【专利技术属性】
技术研发人员：柏银兰，宁唤唤，张芳琳，路延之，常宇骁，董梦娟，康健，代婷，郝乐冉，李嘉玲，胡家豪，张从玥，王姝予，周正言，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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