一种获得高纯度淀粉样多肽Ａβ（１－４０）的方法技术

本发明专利技术属于基因工程和蛋白工程领域，具体涉及一种获得高纯度淀粉样多肽Ａβ（１－４０）的方法。目前，淀粉样多肽多为利用化学合成的手段获得，本发明专利技术首次采用生物工程方法表达可溶性的淀粉样多肽。本发明专利技术以ｓｍｔ３－ｐｏｌｙＱ基因为基础，构建表达质粒，转入大肠杆菌工程菌培养，收集菌体。菌体超声破菌、离心后用Ｎｉ柱纯化，经过ｓｕｐｅｒｄｅｘ？Ｇ－７５分离纯化和除盐处理得到纯度达９５％以上的融合蛋白。然后利用ＳＵＭＯ蛋白酶酶切，后经过镍柱分离纯化，再经过ｓｕｐｅｒｄｅｘ？Ｇ－７５分离纯化和除盐处理可以得到野生型淀粉样多肽Ａβ（１－４０）。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程和蛋白工程领域，涉及一种获得高纯度淀粉样多肽AI3 (1—4。) 的方法。
技术介绍
淀粉样多肽(amyloid beta p印tide简称AP )AP是AD患者脑中老年斑的主 要组成成分，在AD的发病机理的研究中占据着中心地位。是由其前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)经分泌酶(secretase)切割产生的。 正常情况下，APP首先被a-分泌酶酶解后释放出一个大的可溶性胞外结构 域APPa (soluble APP a ， sAPP a )和一个跨膜片断C-83。然后，C-83再经Y-分泌酶 裂解产生一个可溶性的小肽p3，我们称之为非AP途径(non-AP pathway) 。 APP也可先 在e-分泌酶的作用下产生一个可溶性的胞外分泌片断APPI3 (soluble APPP， sAPPP) 以及一个羧基末端片断(C-terminal fragment, CTFP ，又称C99)。然后Y-分泌酶作 用于C99的N-端产生AP和一个APP胞内结构域(APP intracellular domain, AID) (Mattson MP. Cellular actionsof P-amyloid precursor protein and its soluble and fibrillogenicderivatives Physiol Rev 1997， 77 (4) :1081-1132.)。 我们将 这条APP的裂解途径称为途径(APpathway)。但是由于Y-分泌酶切割位点的不 同，导致了多种异构体的产生，其中最常见的当属AI3卜4。和AI^—42，前者是体液中可溶 性AP的主要成分，而后者则是老年斑中沉积态AI3的主要组分(Masters CL， Simms G， Weinman NA， Multhaup G， McDonald BL， Beyreuther K.Amyloid plaquecore protein in Alzheimer' s disease and Down syndrome. Proc Natl AcadSci USA 1985,82(12): 4245-4249. )。 AeH2相对于Ae卜4。在C-端多出2个疏水性氨基酸lle41和Ala42。但是， AP-42比AP-40更容易聚集，神经毒性也更为剧烈(Dahlgren KN，Manelli AM，Stine WB， Jr. ， Baker LK， KrafftGA， LaDu MJ. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-P p印tidesdifferentially affect neuronal viability . J Biol Chem 2002,277(35): 32046-32053 ;Bitan G， Kirkitadze MD， Lomakin A， Vollers SS， Benedek GB， T印low DB. Amyloid beta protein (AP)assembly :AP 40and AP 42oligomerizethrough distinct pathways. Proc Natl Acad Sci U S A 2003,100(1) :330-335. ;Murakami K， Irie K， Morimoto A， Ohigashi H， Shindo M， Nagao M， Shimizu T， Shirasawa T. Neurotoxicity and physicochemical properties ofAP mutant peptides from cerebral amyloid angiopathy -implication for th印athogenesis of cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease J Biol Chem 2003,278(46) :46179-46187.)。虽然有许多证据 表明AP在阿尔茨海默病的发病机理中起着非常重要的作用，但是到目前为止，AI3的毒理 机制还不是很清楚。为了更好的研究淀粉样多肽AI3在阿尔茨海默病的发病机理中的作 用，这就需要首先能获得高纯度的AI3蛋白用于实验研究。到目前为止，各种文献显示实验 中所用淀粉样多肽都是利用化学合成的手段获得，以下为淀粉样多肽的化学合成价格3 amyloid beta p印tide 1-40， 0. 5mg， $248. 30 amyloid beta p印tide 1-42， 0. 5mg， $552. 00 amyloid beta p印tide 1-28， 0. 5mg， $173. 20 正是由于高昂的价格使得很多科学研究望而止步，目前，尚无获得野生型的淀粉 样多月太amyloid beta(1_40) 的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作比较简单，成本低，产率较高，纯度高的野生型淀粉 样多肽APd—4。制备方法。 本专利技术提供了一种获得高纯度淀粉样多肽AI3 (1—4。)的方法，该方法依次包括以下 步骤 (1)将淀粉样多肽AP (1—4。)的核苷酸编码序列构建至表达载体中，并转化至大肠杆 菌工程菌中； (2)将(1)得到的工程菌接种于2YT培养液，常规培养7 12小时，然后用2YT稀 释100倍后继续在37t:下扩大培养3 4小时，在0D6。。 = 0. 8_0. 9加入终浓度为约lmmo1/ 1 (例如1-1. lmmol)的IPTG，然后继续诱导培养8 10小时，离心收集菌体； (3)菌体破菌，离心，过柱，除盐，得到融合蛋白； (4)利用SUM0蛋白酶在4°C -8t:酶切，酶切混合物经过柱纯化，除盐处理，即可得到野生型淀粉样多肽APd—4。)。 本专利技术的方法中，步骤(1)中可以采用大肠杆菌作为工程菌表达淀粉样多肽A P (1—40) ° 本专利技术的方法中，表达载体可以是pET-28b(+)质粒，工程菌可以是大肠杆菌 BL21(DE3)。 本专利技术的方法中，步骤(2)诱导培养可以采用加入IPTG至浓度lmM的方法。 本专利技术的方法中，可以以smt3作为融合蛋白的融合标签。 本专利技术的方法中，步骤(3)中可以采用静态酶切。 本专利技术的方法中，步骤(3)或者步骤(4)中过柱可以是先镍柱纯化，然后经过琼脂 糖G-75纯化。 本专利技术的方法中，步骤(3)或者步骤(4)中除盐可以是用琼脂糖G-25进行除盐。 本专利技术的方法中，"淀粉样多肽AI3 (1—4。)核苷酸编码序列"是指编码具有淀粉样多 肽AP (1—4。) (GENEBANK序列号是NP_000475)的核苷酸序列，如序列中开放阅读框位置核苷 酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于开放阅读框位置核苷酸中，有一个或多个密码 子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与 开放阅读框位置核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出上述序列。 在本专利技术中，术语"淀粉样多肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得高纯度淀粉样多肽Ａβ↓［（１－４０）］的方法，其特征是，该方法依次包括以下步骤：　　（１）将淀粉样多肽Ａβ↓［（１－４０）］的核苷酸编码序列构建至表达载体中，并转化至大肠杆菌工程菌中；　　（２）将（１）得到的工程菌接种于２ＹＴ培养液，常规培养７～１２小时，然后用２ＹＴ稀释１００倍后继续在３７℃下扩大培养３～４小时，在ＯＤ↓［６００］＝０．８－０．９加入终浓度为１ｍＭ的ＩＰＴＧ，然后继续诱导培养８～１０小时，离心收集菌体；　　（３）菌体破菌，离心，过柱，除盐，得到融合蛋白；　　（４）利用ＳＵＭＯ蛋白酶在４℃－８℃酶切，酶切混合物经过柱纯化，除盐处理，即可得到野生型淀粉样多肽Ａβ↓［（１－４０）］。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谭相石，包勤贵，丁志春，黄仲贤，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]