一种胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系及其构建方法技术

本发明专利技术提供了一种胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系，以及该细胞系的构建方法和应用。本发明专利技术提供的胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系通过胚胎干细胞和肿瘤细胞融合获得，其构建方法包括以下步骤：Ａ）分别构建胚胎干细胞和肿瘤细胞的单克隆细胞株；Ｂ）胚胎干细胞和肿瘤细胞的单克隆细胞株融合。本发明专利技术提供的细胞系可用于构建肿瘤细胞模型。本发明专利技术提供的杂合细胞，为进一步研究肿瘤的发生和恶化提供了一种全新的模型，使用本发明专利技术提供的方法，可以构建新的杂合细胞模型，从而从全新的角度研究肿瘤表观遗传学，对未来的临床治疗提供理论和应用基础，将会全面推动肿瘤的基础研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说，涉及胚胎干细胞，更具体地说，涉及一种胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系及其构建方法。
技术介绍
胚胎干细胞是来自于囊胚内细胞团的多能性细胞。近年来研究者发现，胚胎干细胞可以通过细胞融合改变成体细胞的表观遗传学特性。体细胞和胚胎来源的细胞融合重新编程的关键在于通过细胞融合，体细胞核内的物质可以有效地和胚胎来源细胞核内的物质进行动态的相互影响，在此过程中，胚胎来源干细胞有效的改变体细胞的基因表达核染色体结构，使其恢复到未分化的状态。研究显示畸胎瘤细胞，胚胎干细胞(ES cells)和胚胎生殖细胞(EG cells)等都有相应的重新编程体细胞的能力。 但尚未见有胚胎干细胞和肿瘤细胞形成的杂合细胞系的报道，因此，胚胎干细胞是否可以通过细胞融合改变肿瘤细胞的表观遗传学特性也未知。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系，以提供一种研究肿瘤细胞的新的模型。 本专利技术还有一个目的在于，提供一种胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系的构建方法。 本专利技术还有一个目的在于，提供一种胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系的应用。 本专利技术提供的胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系通过胚胎干细胞和肿瘤细胞融合获得。 本专利技术提供的胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系的构建方法，包括以下步骤 A)分别构建胚胎干细胞和肿瘤细胞的单克隆细胞株； B)胚胎干细胞和肿瘤细胞的单克隆细胞株融合。 根据本专利技术的一个优选实施例，所述方法还包括杂合细胞的筛选步骤。 根据本专利技术的一个优选实施例，所述方法还包括杂合细胞单克隆株构建的步骤。 本专利技术提供的胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系的应用为用于构建去分化的肿瘤细胞的应用。 本专利技术提供的胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系的应用为用于构建肿瘤细胞模型。 本专利技术提供的杂合细胞，为进一步的研究肿瘤的发生和恶化提供了一种全新的模型，使用本专利技术提供的方法，可以构建新的杂合细胞模型，从而从全新的角度研究肿瘤表观遗传学，对未来的临床治疗提供理论和应用基础，将会全面推动肿瘤的基础研究。附图说明 图1是融合前胚胎干细胞E14和肿瘤细胞的单克隆细胞系的荧光检测结果，其中，图1A为E14的荧光检测结果，图IB为肿瘤细胞H印al-6细胞的荧光检测结果。 图2是杂合细胞的表型的荧光检测结果，其中，图A-C依次为胚胎干细胞样，成纤维样，和上皮样细胞表型的杂合细胞，l-4分别为相应细胞样的明场图像，绿色荧光标记图像、红色荧光标记图像、红色和绿色荧光重叠图像。 图3是胚胎干细胞，成体肿瘤细胞H印al-6以及杂合细胞的染色体核型与DNA含 量检测结果示意图，其中，A-C依次代表胚胎干细胞，成体肿瘤细胞H印al-6以及杂合细胞， 1和2分别为染色体核型检测结果与DNA含量检测结果的示意图。 图4是杂合细胞的基因表达的电泳图，其中，图4A为E14(1)、 H印al-6(2)、 EH0926(3)和EH0929(4)中多能性基因0CT4、 Rexl、 Nanog、 S0X2和组织特异性基因TTR、 ALB的表达检测结果；图4B为胚胎干细胞ES(l)、成体肿瘤H印all-6(2)和杂合细胞 ESXH印al-6(3)中肿瘤抑制基因P19、 P16、原癌基因C-fos和P actin的表达检测结果。 图5是杂合细胞在体外形成拟胚体的检测结果，其中，图5A是明场下的拟胚体的 检测结果，图5B是融合细胞形成的拟胚体表达的红色荧光的观测结果；图5C是融合细胞形 成的拟胚体表达的绿色荧光的观测结果；图5D是图5B和图5C的重叠影像。 图6是胚胎干细胞(A)，成体肿瘤H印al-6(B)和杂合细胞(C)在体外形成的肿瘤 细胞的组织切片检测结果，其中，图6A中切片图1-4分别为四倍镜下畸胎瘤组织类型的切 片图；二十倍镜下神经胶质细胞的切片图；二十倍镜下脂肪组织的切片图；二十倍镜下肌 肉组织的切片图；图6B中的切片图1为四倍镜下H印al-6的组织类型的切片图；切片图2 为二十倍镜下肿瘤组织的边缘图片的切片图，切片图3为二十倍镜下肿瘤组织的内部图片 的切片图；图6C中切片图1-4分别为四倍镜下畸胎瘤组织类型的切片图；二十倍镜下神经 胶质细胞的切片图；二十倍镜下脂肪组织的切片图；二十倍镜下肌肉组织的切片图，其中， 箭头所指为未分化神经管组织。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 专利技术而非用于限定本专利技术的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实 验室手册》(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件进行。 在本专利技术的下述实施例中，使用的E14细胞系购自于中科院干细胞平台(其编号 为SCSP-205)，肿瘤细胞H印al-6(肝癌细胞)购自于中科院细胞库(其编号为TCM30)，来 自于小鼠肝癌，是分化程度高的成体肿瘤细胞。 在本专利技术的下述实施例中，使用的慢病毒Hygromycin-RFP参考文献Jo 1 anta Szulc et.al. A Versatile Tool for Conditional Gene Expression and Knockdown. Nature Methods, 3， 109-116 (2006)中提供的方法构建。 在本专利技术的下述实施例中，使用的TE buffer、 Buffer EC、促进反应缓冲液 (enhancer)和改良的脂类转染试剂(Effectene Transfection Reagent)均为瞬时转染试 剂盒内试剂，该试剂盒购自Qiagen ;G418购自Gibco BRL ;4， 6-联脒_2_苯基吲哚二盐酸盐4(DAPI)和Rnase购自Sigma ;碘化丙啶(Propidium Iodide)购自Invitrogen ;GAPDH购自上海生工合成；PEGFPC1 DNA购自Clontech ;2XSYBRGreen master mix购自Qiagen。 在本专利技术的下述实施例中，使用的TRIzol总RNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；RT-PCR试剂盒购自上海申能博采生物技术公司。 在本专利技术的下述实施例中，使用的nu小鼠购自中科院动物中心。 在本专利技术的下述实施例中，使用的胚胎干细胞培养基的配方为每400ml培养基含有343. 2ml格拉斯哥极限必需培养基，40ml 10%FBS，4ml 0. lmM非必需氨基酸，4ml lmM丙酮酸钠，O. lmM P巯基乙醇，40ul 1000U/ml LIF， 2ml青霉素-链霉素双抗。 在本专利技术的下述实施例中的"融合母体细胞"指的是融合前的细胞。 在本专利技术的下述实施例中，由于转染成功的E14细胞系具有潮霉素抗性，因此，可使用潮霉素(Hygromycin)筛选转染后的E14细胞系；由于H印al-6细胞内具有新霉素抗性，因此，可使用G418筛选H印al-6细胞系。联合两种抗生素可以筛选融合后的融合细胞系。 ^ML丄、融合前的单克隆细胞系构建 1. 1、胚胎干细胞E14单克隆细胞株构建 参照Gondon keller建立起来的无滋养层胚胎干细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王欣，姚嘉宜，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]