【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水稻有性杂交育种，尤其涉及一种可视化分选的显性核不育系构建方法及在水稻有性杂交育种中应用。
技术介绍
1、有性杂交是一项利用不同遗传背景的亲本杂交来产生优良重组性状或创造有利变异的育种技术，已广泛用于常规稻或杂交稻亲本遗传改良。由于水稻是自花授粉作物，所以在有性杂交育种流程中，需要通过人工去除母本颖花中的雄性器官来防止自交种的产生。当今社会经济发展迅速，农业劳动力尤其是掌握农业生产技能和水稻有性杂交技术的熟练工人日益短缺，传统的人工去雄方法劳动强度大、效率低，越来越难以满足大规模、工厂化的商业化水稻育种的需求。因此，发掘或创制特异性种质资源来免除人工去雄的有性杂交系统，对于提高常规水稻和杂交稻亲本的育种效率具有重要意义。
2、显性核不育材料的不育性状由显性不育基因控制，不论基因型是纯合(ms/ms)还是杂合(ms/ms)，都表现为雄性不育。当杂合态(或半合态)显性不育株接受正常育性植株花粉受精时，子代将分离出一半显性核不育株和一半隐性可育株。其中，后代分离的显性核不育株可继续接受其他正常育性植株花粉，产生更多的重组性状或有利变异；而分离的隐性可育株群体可作为重组性状选择池，从中选择优良目标单株。因此，显性核不育材料可用于构建简便、高效的有性杂交模式，是突破水稻人工去雄育种技术瓶颈的有效途径，在水稻有性杂交育种中具有重大应用潜力。但现有报道的水稻显性核不育材料不多，主要为“三明显性核不育”和“萍乡显性核不育”等10余份由内源基因突变导致的显性核不育材料，一般存在育性不稳定、杂交种子无法分选等不利因素，导致
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种可视化分选的显性核不育系构建方法及在水稻有性杂交育种中应用，既雄性败育彻底、又能直接分离不育种子的显性核不育水稻，用于提高水稻有性杂交育种的效率。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
3、一种可视化分选的显性核不育系构建方法，包括以下步骤：
4、s1、将水稻绒毡层退化调控基因tdr和红色荧光蛋白dsred2基因导入水稻基因组；
5、s2、采用pcr和ddpcr方法筛选单拷贝半合子的阳性株系；
6、s3、观察所述阳性株系的花药，筛选不含花粉或花粉不育度彻底的显性核不育系：dms-td；
7、s4、显性核不育系dms-td种子，采用与野生型异交方式繁殖。
8、s5、野生型花粉传至显性核不育系dms-td柱头，异交繁殖显性核不育系种子；异交繁殖显性核不育系dms-td种子发红色荧光，占异交结实种子的一半，可用作有性杂交育种遗传工具。显性核不育系种子可借助红色荧光激发装置分选出来，且基因组与原始显性核不育系基因组相同。
9、上述的显性核不育系构建方法，进一步的，所述s1具体包括：以植物表达载体pcambia1300为骨架，按顺序逐步连接p5126花药特异性启动子、水稻绒毡层退化调控基因tdr编码区、tnos终止子的表达框1以及pltp胚乳特异性启动子、红色荧光蛋白基因dsred2、tpinii终止子的表达框2，形成所述表达框1和所述表达框2在水稻基因组上紧密连锁的遗传转化表达载体。
10、上述的显性核不育系构建方法，进一步的，所述表达框1和所述表达框2在水稻基因组上紧密连锁的遗传转化表达载体为pdms-td。所述表达框1用于紊乱绒毡层细胞正常的程序性死亡，获得水稻显性核不育表型。所述表达框2使水稻胚乳中表达红色荧光蛋白，用于标记由tdr异位表达所形成的显性核不育种子。
11、上述的显性核不育系构建方法，进一步的，所述p5126花药特异性启动子的基因序列如seq id no.1所示；
12、所述水稻绒毡层退化调控基因tdr编码区的基因序列如seq id no.2所示；
13、所述tnos终止子的基因序列如seq id no.3所示；
14、所述pltp胚乳特异性启动子的基因序列如seq id no.4所示；
15、所述红色荧光蛋白基因dsred2的基因序列如seq id no.5所示；
16、所述tpinii终止子的基因序列如seq id no.6所示。
17、上述的显性核不育系构建方法，进一步的，所述s2具体包括：通过pcr检测dsred2基因获得阳性转基因株系，再利用数字pcr从所述阳性转基因株系中筛选dsred2分子数为sps1的分子数一半的单株，即为单拷贝半合子的阳性株系。
18、上述的显性核不育系构建方法，进一步的，pcr检测dsred2基因所用引物为dsred-f和dsred-r；所述dsred-f的dna序列如seq id no.7所示；所述dsred-r的dna序列如seq idno.8所示。
19、数字pcr，计数荧光蛋白基因dsred2的分子数目所用引物为dsred-ddpcr-f和dsred-ddpcr-r，探针为dsred-p；所述dsred-ddpcr-f的dna序列如seq id no.9所示；所述dsred-ddpcr-r的dna序列如seq id no.10所示；所述dsred-p的dna序列如seq id no.11所示。
20、计数水稻内参基因sps1的分子数目所用引物为sps1-ddpcr-f和sps1-ddpcr-r，探针为sps1-p；所述sps1-ddpcr-f的dna序列如seq id no.12所示；所述sps1-ddpcr-r的dna序列如seq id no.13所示；所述sps1-p的dna序列如seq id no.14所示。
21、上述的显性核不育系构建方法，进一步的，所述s4具体包括：以所述dms-td为花粉受体，将野生型花粉授到所述花粉受体的柱头，异交繁殖获得种子；其中发红色荧光的种子为繁殖的显性核不育株系种子，用作有性杂交育种遗传工具。
22、上述的显性核不育系构建方法，进一步的，所述s4中，与野生型异交繁殖的所述显性核不育dms-td种子，因花粉供体和花粉受体的基因组相同，其基因组与原显性核不育系基因组一致。
23、基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种上述显性核不育系dms-td在水稻有性杂交育种中应用，所述显性核不育系用作水稻有性杂交育种遗传工具。
24、上述的应用，进一步的，所述应用的方法包括：
25、(1)将花粉供体a(非野生型)正常播种，显性核不育系作为花粉受体分三批播种和插秧；
26、(2)观察植株开花情况，将即将开花的显性核不育系挖至正在开花的花粉供体a植株群体的中间位置，使花粉供体a的花粉传至显性核不育系的柱头上；
27、(3)收获显性核不育系植株上的异交种子，其中有荧光的种子为显性核不育系a1，无荧光的种子a2不含转基因成分；
28、(4)下一季种植有荧光的所述显性核不育系a1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可视化分选的显性核不育系构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的显性核不育系构建方法，其特征在于，所述S1具体包括：以植物表达载体pCAMBIA1300为骨架，按顺序逐步连接P5126花药特异性启动子、水稻绒毡层退化调控基因TDR编码区、TNos终止子的表达框1以及PLTP胚乳特异性启动子、红色荧光蛋白基因DsRed2、TPINII终止子的表达框2，形成所述表达框1和所述表达框2在水稻基因组上紧密连锁的遗传转化表达载体。
3.根据权利要求2所述的显性核不育系构建方法，其特征在于，所述表达框1和所述表达框2在水稻基因组上紧密连锁的遗传转化表达载体为pDMS-TD；
4.根据权利要求2所述的显性核不育系构建方法，其特征在于，所述表达框1用于紊乱绒毡层细胞正常的程序性死亡，获得水稻显性核不育表型；所述表达框2使水稻胚乳中表达红色荧光蛋白，用于标记由TDR异位表达所形成的显性核不育种子。
5.根据权利要求1所述的显性核不育系构建方法，其特征在于，所述S2具体包括：通过检测DsRed2基因获得阳性转基因株系，再利
6.根据权利要求1所述的显性核不育系构建方法，其特征在于，所述S4具体包括：以所述DMS-TD为花粉受体，将野生型花粉授到所述花粉受体的柱头，异交繁殖获得种子；其中发红色荧光的种子为繁殖的显性核不育株系种子，用作有性杂交育种遗传工具。
7.根据权利要求1所述的显性核不育系构建方法，其特征在于，所述S4中，与野生型异交繁殖的所述显性核不育DMS-TD种子，因花粉供体和花粉受体的基因组相同，其基因组与原显性核不育系基因组一致。
8.一种权利要求1至7中任一项所述的显性核不育系构建方法构建的显性核不育系在水稻有性杂交育种中应用，其特征在于，所述显性核不育系用作水稻有性杂交育种遗传工具。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括：
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述(1)中，显性核不育系分三批播种具体包括：第一批比花粉供体早14天播种，第二批与花粉供体同期播种，第三批晚花粉供体10天播种；
...【技术特征摘要】
1.一种可视化分选的显性核不育系构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的显性核不育系构建方法，其特征在于，所述s1具体包括：以植物表达载体pcambia1300为骨架，按顺序逐步连接p5126花药特异性启动子、水稻绒毡层退化调控基因tdr编码区、tnos终止子的表达框1以及pltp胚乳特异性启动子、红色荧光蛋白基因dsred2、tpinii终止子的表达框2，形成所述表达框1和所述表达框2在水稻基因组上紧密连锁的遗传转化表达载体。
3.根据权利要求2所述的显性核不育系构建方法，其特征在于，所述表达框1和所述表达框2在水稻基因组上紧密连锁的遗传转化表达载体为pdms-td；
4.根据权利要求2所述的显性核不育系构建方法，其特征在于，所述表达框1用于紊乱绒毡层细胞正常的程序性死亡，获得水稻显性核不育表型；所述表达框2使水稻胚乳中表达红色荧光蛋白，用于标记由tdr异位表达所形成的显性核不育种子。
5.根据权利要求1所述的显性核不育系构建方法，其特征在于，所述s2具体包括：通过检测dsred2基因获得阳性转基因株系，再利用数...
【专利技术属性】
技术研发人员：余东，李莉，袁定阳，周天顺，王天抗，盘毅，胡忠孝，李懿星，宋书锋，谭勇俊，
申请(专利权)人：湖南杂交水稻研究中心，
类型：发明
国别省市：
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