本发明专利技术涉及植物基因工程领域。具体而言，本发明专利技术涉及一种改进的mRNA及递送方法，特别是所述改进的mRNA在植物中具有提高的翻译效率。更具体而言，本发明专利技术通过优化mRNA的5’UTR(untranslated regions)和polyA尾，提高了mRNA在植物中的翻译效率。本发明专利技术还涉及通过用Protamine包被所述mRNA来提高其向植物细胞递送的效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程领域。具体而言，本专利技术涉及一种改进的mrna及递送方法，特别是所述改进的mrna在植物中具有提高的翻译效率。更具体而言，本专利技术通过优化mrna的5’utr(untranslated regions)和polya尾，提高了mrna在植物中的翻译效率。本专利技术还涉及通过用protamine包被所述mrna来提高其向植物细胞递送的效率。
技术介绍
0、专利技术背景
1、基因组编辑技术是指利用序列特异性核酸酶zfn、talens和crispr/cas在基因组定点的产生双链断裂,从而激活细胞自身修复机制完成对断裂处的修复。后来科学家们又基于crispr/cas系统开发出了可以进行高效单碱基替换的碱基编辑系统cbe和abe，这两个系统可以分别实现精准的cg>ta和at>gc，以及最新的引导编辑系统，该系统可以在基因组上定点的实现任意类型的碱基替换，长短片段的精准插入与删除。
2、近年来许多重要的农作物的基因组都完成了测序，组装和注释，我们根据功能基因组的信息并结合基因组编辑技术可以高效精准的对农作物进行性状改良，而实现这些设想的前提必须将基因组编辑系统递送到植物体内。目前已经有大量文章报道，通过农杆菌法对水稻、玉米、大豆等植物进行转化并成功获得了基因编辑植株，但是这些植株均稳定整合了外源的基因片段，在商业化的过程中会受到严格的管控。有研究表明，通过基因枪法转化小麦可以在t0代获得无外源dna整合的基因编辑植株。其具体原理为，利用基因枪法转化小麦未成熟幼胚，在整个组织培养的过程中不进行筛选，将所有再生出的幼苗进行基因型鉴定，由于在基因枪轰击的过程中，外源质粒有一定的概率不整合到基因组上且瞬时表达出cas9和sgrna，所以可以得到的无外源dna整合的小麦植株。之后有文章报道，在体外将cas9蛋白和sgrna孵育组装成rnp复合体，之后利用基因枪法进行递送，成功的在小麦和玉米中实现了基因编辑并在t0代获得了无外源dna整合的植株。但是以上两种快速获得无外源dna整合的突变体的方法均有不足之处，在基因枪轰击的过程中，质粒难免会断裂，断裂产生的小片段dna插入到基因组上很难通过常规的pcr检测到，而利用rnp形式进行递送需要制备蛋白，该过程费时费力并且有些蛋白的体外表达和纯化很困难。而选择用mrna形式进行递送，样品的制备过程简单而且rna不会整合到基因组上。但目前植物领域仅有一篇文献报道利用基因枪法递送cas9的mrna进行小麦的基因编辑，效率仅为1.1％。如此低的效率远远无法满足实际应用的需求，并且该工作对其他基因编辑工具比如cbe和abe等没有进行测试，在其他物种比如水稻、玉米等中的工作效果也未曾可知。因此，在植物中开发具有普适性且高效的mrna递送系统将极大地降低研发生产的成本，为研究人员利用各种类型的基因组编辑工具对植物进行遗传改良提供了有力支持，在基因编辑产品的商业化过程中有着重大的应用前景。
技术实现思路
0、专利技术简述
1、本专利技术提供至少以下实施方案：
2、实施方案1.一种mrna分子，所述mrna分子从5’端到3’端方向包含5’非翻译区(5’utr)、感兴趣的多肽的编码核苷酸序列、和polya尾，其中
3、i)所述polya尾的长度为至少50nt、至少75nt、至少100nt、至少120nt、至少150nt、至少200nt甚至更长，和/或
4、ii)所述5’utr包含与seq id no:1-7和17-23中任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的核苷酸序列。
5、实施方案2.实施方案1的mrna分子，其中所述mrna分子在其polya尾的3’末端不包含任何其它的核苷酸，例如，所述mrna分子在其polya尾的3’末端不包含t、u、c和/或g。
6、实施方案3.实施方案1或2的mrna分子，所述5’utr包含与seq id no:7具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、、至少99％序列相同性的核苷酸序列，优选地，所述5’utr包含seq id no:7所示核苷酸序列；或者
7、所述5’utr包含与seq id no:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的核苷酸序列，优选地，所述5’utr包含seq id no:2所示核苷酸序列；或者
8、所述5’utr包含与seq id no:17-23之一具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的核苷酸序列，优选地，所述5’utr包含seq id no:17-23之一所示核苷酸序列。
9、实施方案4.实施方案1-3中任一项的mrna分子，其用于在植物细胞中表达外源的感兴趣的多肽。
10、实施方案5.实施方案4的mrna分子，所述植物选自小麦、草莓、水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯和马铃薯。
11、实施方案6.实施方案1-5中任一项的mrna分子，其中所述mrna分子是通过化学合成产生或通过体外转录产生。
12、实施方案7.实施方案1-6中任一项的mrna分子，其中所述感兴趣的多肽是负责对农学、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性、不育性、和商业产品而言重要的性状的多肽，例如，所述感兴趣的多肽包括参与油、淀粉、碳水化合物或营养素代谢的那些多肽，以及影响果实大小、蔗糖载量的多肽。
13、实施方案8.实施方案1-6中任一项的mrna分子，其中所述感兴趣的多肽是基因编辑系统的组分，例如所述感兴趣的多肽选自锌指核酸酶、大范围核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶和crispr核酸酶或其变体，从而所述mrna分子可以用于对植物进行基因编辑。
14、实施方案9.一种核酸载体，其包含与体外转录调控元件可操作地连接的实施方案1-8中任一项的mrna分子的编码序列，且用于体外转录产生实施方案1-8中任一项的mrna分子。
15、实施方案10.实施方案9的核酸载体，所述核酸载体是线性dna分子，且其3’末端为polyt且不包含任何其它的核苷酸，例如其3’末端不包含a、c和/或g。
16、实施方案11.实施方案9的核酸载体，所述核酸载体是环形dna分子例如质粒，其在体外转录前进行线性化。
17、实施方案12.实施方案11的核酸载体，其中在所述mrna分子的编码序列的3’末端进行所述线性化。
18、实施方案13.实施方案12的核酸载体，其中所述mrna分子的编码序列的3’末端包含用于进行线性化的bsai酶切位，由此所述核酸载体可以通过bsai消化产生产生3’末端为polyt且不包含任何其它核苷酸，例如其3’末端不包含a、c和/或g的线性d本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种mRNA分子，所述mRNA分子从5’端到3’端方向包含5’非翻译区(5’UTR)、感兴趣的多肽的编码核苷酸序列、和polyA尾，其中
2.权利要求1的mRNA分子，其中所述mRNA分子在其polyA尾的3’末端不包含任何其它的核苷酸，例如，所述mRNA分子在其polyA尾的3’末端不包含T、U、C和/或G。
3.权利要求1或2的mRNA分子，所述5’UTR包含与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、、至少99％序列相同性的核苷酸序列，优选地，所述5’UTR包含SEQ ID NO:7所示核苷酸序列；或者
4.权利要求1-3中任一项的mRNA分子，其用于在植物细胞中表达外源的感兴趣的多肽。
5.权利要求4的mRNA分子，所述植物选自小麦、草莓、水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯和马铃薯。
6.权利要求1-5中任一项的mRNA分子，其中所述mRNA分子是通过化学合成产生或通过体外转录产生。
>7.权利要求1-6中任一项的mRNA分子，其中所述感兴趣的多肽是负责对农学、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性、不育性、和商业产品而言重要的性状的多肽，例如，所述感兴趣的多肽包括参与油、淀粉、碳水化合物或营养素代谢的那些多肽，以及影响果实大小、蔗糖载量的多肽。8.权利要求1-6中任一项的mRNA分子，其中所述感兴趣的多肽是基因编辑系统的组分，例如所述感兴趣的多肽选自锌指核酸酶、大范围核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶和CRISPR核酸酶或其变体，从而所述mRNA分子可以用于对植物进行基因编辑。
9.一种核酸载体，其包含与体外转录调控元件可操作地连接的权利要求1-8中任一项的mRNA分子的编码序列，且用于体外转录产生权利要求1-8中任一项的mRNA分子。
10.权利要求9的核酸载体，所述核酸载体是线性DNA分子，且其3’末端为polyT且不包含任何其它的核苷酸，例如其3’末端不包含A、C和/或G。
11.权利要求9的核酸载体，所述核酸载体是环形DNA分子例如质粒，其在体外转录前进行线性化。
12.权利要求11的核酸载体，其中在所述mRNA分子的编码序列的3’末端进行所述线性化。
13.权利要求12的核酸载体，其中所述mRNA分子的编码序列的3’末端包含用于进行线性化的BsaI酶切位，由此所述核酸载体可以通过BsaI消化产生产生3’末端为polyT且不包含任何其它核苷酸，例如其3’末端不包含A、C和/或G的线性DNA分子。
14.一种在植物细胞中表达感兴趣的多肽的方法，包括向植物细胞导入mRNA分子，所述mRNA分子从5’端到3’端方向包含5’非翻译区(5’UTR)、感兴趣的多肽的编码核苷酸序列、和polyA尾，其中
15.权利要求14的方法，其中所述polyA尾的长度为至少50nt、至少75nt、至少100nt、至少120nt、至少150nt、至少200nt甚至更长。
16.权利要求14或15的方法，其中所述mRNA分子在其polyA尾的3’末端不包含任何其它的核苷酸，例如所述mRNA分子在其polyA尾的3’末端不包含T、U、C和/或G。
17.权利要求14-16中任一项的方法，所述5’UTR包含与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的核苷酸序列，优选地，所述5’UTR包含SEQ ID NO:7所示核苷酸序列；或者
18.权利要求14-17中任一项的方法，其中所述mRNA分子是通过化学合成产生或通过体外转录产生。
19.权利要求14-18中任一项的方法，其中所述mRNA分子通过基因枪法、PEG介导的原生质体转化、花粉管通道法或子房注射法导入植物细胞。
20.权利要求14-19中任一项的方法，其中用Protamine包被所述mRNA分子来将所述mRNA分子导入所述植物细胞。
21.权利要求20的方法，其中将Protamine与所述mRNA分子以大约1:2-大约3.5:1，优选大约1.5:1的质量浓度比混合以用Protamine包被所述mRNA分子。
22.权利要求20或21的方法，其中所述通过基因枪法将所述Protamine包被的mRNA分子导入所述植物细胞。
23.权利要求22的方法，其中所述Protamine包被的mRNA分子附着于金属颗粒如金颗粒或钨颗粒上。...
【技术特征摘要】
1.一种mrna分子，所述mrna分子从5’端到3’端方向包含5’非翻译区(5’utr)、感兴趣的多肽的编码核苷酸序列、和polya尾，其中
2.权利要求1的mrna分子，其中所述mrna分子在其polya尾的3’末端不包含任何其它的核苷酸，例如，所述mrna分子在其polya尾的3’末端不包含t、u、c和/或g。
3.权利要求1或2的mrna分子，所述5’utr包含与seq id no:7具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、、至少99％序列相同性的核苷酸序列，优选地，所述5’utr包含seq id no:7所示核苷酸序列；或者
4.权利要求1-3中任一项的mrna分子，其用于在植物细胞中表达外源的感兴趣的多肽。
5.权利要求4的mrna分子，所述植物选自小麦、草莓、水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯和马铃薯。
6.权利要求1-5中任一项的mrna分子，其中所述mrna分子是通过化学合成产生或通过体外转录产生。
7.权利要求1-6中任一项的mrna分子，其中所述感兴趣的多肽是负责对农学、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性、不育性、和商业产品而言重要的性状的多肽，例如，所述感兴趣的多肽包括参与油、淀粉、碳水化合物或营养素代谢的那些多肽，以及影响果实大小、蔗糖载量的多肽。
8.权利要求1-6中任一项的mrna分子，其中所述感兴趣的多肽是基因编辑系统的组分，例如所述感兴趣的多肽选自锌指核酸酶、大范围核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶和crispr核酸酶或其变体，从而所述mrna分子可以用于对植物进行基因编辑。
9.一种核酸载体，其包含与体外转录调控元件可操作地连接的权利要求1-8中任一项的mrna分子的编码序列，且用于体外转录产生权利要求1-8中任一项的mrna分子。
10.权利要求9的核酸载体，所述核酸载体是线性dna分子，且其3’末端为polyt且不包含任何其它的核苷酸，例如其3’末端不包含a、c和/或g。
11.权利要求9的核酸载体，所述核酸载体是环形dna分子例如质粒，其在体外转录前进行线性化。
12.权利要求11的核酸载体，其中在所述mrna分子的编码序列的3’末端进行所述线性化。
13.权利要求12的核酸载体，其中所述mrna分子的编码序列的3’末端包含用于进行线性化的bsai酶切位，由此所述核酸载体可以通过bsai消化产生产生3’末端为polyt且不包含任何其它核苷酸，例如其3’末端不包含a、c和/或g的线性dna分子。
14.一种在植物细胞中表达感兴趣的多肽的方法，包括向植物细胞导入mrna分子，所述mrna分子从5’端到3’端方向包含5’非翻译区(5’utr)、感兴趣的多肽的编码核苷酸序列、和polya尾，其中
15.权利要求14的方法，其中所述polya尾的长度为至少50nt、至少75nt、至少100nt、至少120nt、至少150nt、至少200nt甚至更长。
16.权利要求14或15的方法，其中所述mrna分子在其polya尾的3’末端不包含任何其它的核苷酸，例如所述mrna分子在其polya尾的3’末端不包含t、u、c和/或g。
17.权利要求14-16中任一项的方法，所述5’utr包含与seq id no:7具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的核苷酸序列，优选地，所述5’utr包含seq id no:7所示核苷酸序列；或者
18.权利要求14-17中任一项的方法，其中所述mrna分子是通过化学合成产生或通过体外转录产生。
19.权利要求14-18中任一项的方法，其中所述mrna分子通过基因枪法、peg介导的原生质体转化、花粉管通道法或子房注射法导入植物细胞。
20.权利要求14-19中任一项的方法，其中用protamine包被所述mrna分子来将所述mrna分子导入所述植物细胞。
21...
【专利技术属性】
技术研发人员：高彩霞，邱枫倜，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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