血管抑素受体β亚基人源化嵌合及人抗体、其制备及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体，为鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的信号肽区和可变区与人ＩｇＧ１的恒定区嵌合获得。本发明专利技术还具体公开了该人源化嵌合抗体的制备方法及其在抗肿瘤上的应用。本发明专利技术的人源化嵌合抗体与鼠源的血管抑素受体β亚基单克隆抗体相比，免疫原性低，副作用小，在保持其抗血管抑素受体β亚基活性的同时，更适于体内应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗体，具体涉及血管抑素受体e亚基人源化嵌合及人抗体、其制备及应用。
技术介绍
血管抑素受体(Angiostatin Rec印tor F1F0-ATP合成酶)对肿瘤细胞中ATP合 成起重要作用。在正常人体组织中，血管抑素受体主要在线粒体内膜上定位，但也有少量存 在于内皮细胞的细胞膜上。相对而言，很多肿瘤细胞超量表达血管抑素受体，并大量定位于 细胞膜上。因而肿瘤细胞膜上的血管抑素受体是一个潜在的抗肿瘤药物靶标。 传统认为，血管抑素受体(ATP synthase)是仅存在于真核细胞线粒体内膜上的多 亚单位复合酶分子，在氧化磷酸化的过程中，利用电子传递链酶复合体建立的质子动势合 成ATP，是一个将ATP合成与水解(由Fl亚单位介导)同质子转运装置的旋转(由F0亚 单位介导)耦联的机械化学酶。该酶由脂溶性的、镶于线粒体内膜中的定位复合体FO和 水溶性的、基质侧的合成复合体F1构成。F0由a、 b、 c、 d、 e、 f、 g、 A6L、 OSCP及偶联因子 6等亚基构成，其中a、 b、 c为主要构成亚基。Fl由亚基a 、 |3 、 y 、 S 、 e构成，其比例为3:3:1:1: i，其中a、 e亚基成对存在，该酶的催化位点就位于e亚基。FO是质子通道，F1的正常功能是合成ATP，在缺乏质子梯度时F1具有水解ATP的非正常生理功能。 FO的a亚基含有两个局部通道，质子若要跨膜，需经其中一个通道进入a亚基的中心，结合 众多c亚基中的一个，并经c亚基的旋转被转移到a亚基的另一个通道。c亚基锚定于Fl 的Y亚基(转子的构成部分)，而a亚基通过b亚基(定子)锚定于a3l3 3六聚体。因 此，FO上c亚基相对于a亚基的转动将带动Fl上Y亚基相对于a 3 13 3六聚体的转动，合 成ATP。 IF1 (inhibitor of Fl)是Fl的内源性抑制因子，抑制其ATP水解活性。 近年发现，ATP合成酶不仅存在于线粒体内膜，在内皮细胞和肿瘤细胞质膜表面也 有表达。1995年，Mozer和Pizzo对血管抑素(环饼域1_3)在内皮细胞表面的结合位点 进行了鉴定。通过对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)膜组分进行配体杂交，成功分离了与血管 抑素结合的，大小约55kD的蛋白。通过对蛋白进行氨基末端测序、肽指纹图谱及免疫学分 析表明，抗肿瘤血管新生药血管抑素在该细胞表面的受体为人血管抑素受体的亚基 (基因名分别为ATP5A1和ATP5B)。这一受体在细胞表面的存在通过流式细胞术和免疫荧 光分析得到了证实。另外，血管抑素能与重组ATP5A1结合，抗ATP5A1的抗体能将血管抑素 的抗细胞增殖效果抑制掉90 % 。综上所述，细胞表面的ATP5A1/ATP5B是血管抑素在内皮细 胞表面的受体，血管抑素可能通过与ATP5A1/ATP5B亚基的结合，抑制内皮细胞的增殖和迁 移，从而抑制血管新生。 在Mozer的研究公开前，关于血管抑素受体在细胞膜表面定位的报道仅有一例， 是定位于肿瘤细胞系A549的表面。在Mozer的研究公开后，血管抑素与细胞表面ATP合成 酶的结合，又被其它的研究团体在不同的肿瘤细胞类型证实。在除内皮细胞外的许多其它 类型细胞，包括肿瘤细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞都发现了定位于细胞膜表面的血管抑素受体，这些类型的细胞都具有较强的增殖力，而在红细胞中未发现。这提示膜表达的 人血管抑素受体可能具有促增殖作用，不仅是肿瘤的标志，还可能是癌变的促因，这对肿瘤 的早期诊断和预后具有重大的意义。如果能成功验证膜表达的人血管抑素受体对肿瘤的促 进作用，将使其肿瘤靶标的地位进一步巩固，并可针对其促增殖功能设计相应的药物进行 抑制，以期特异高效地治疗肿瘤。 Chi等用纯化的E. coli F1-ATP合成酶免疫小鼠，得到21株单克隆抗体(mAb)，其 中只有一株mAb是针对催化亚基ATP5B的，其余20株均是针对非催化亚基ATP5A1的，而只 有针对13亚基的那株mAb具有抑制Fl-ATP合成酶活性的作用。但是该mAb为鼠源性，在 人体中极易产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，使mAb用于治疗的研究受到限制。 嵌合抗体是通过基因工程将鼠源单抗可变区和人抗体恒定区拼接的抗体，相对于 其它人源化抗体的优点在于其技术路线简单；抗体完整性好，体内潴留期长。利妥昔单抗 (rituximab)于1997年获得FDA批准，是全球第一个上市的抗肿瘤mAb药物，用于治疗CD20 阳性的B淋巴细胞性非霍奇金淋巴瘤，该抗体就是一个嵌合抗体。第一个用于临床的嵌合 抗体是阿来组单抗(alemtuzumab)，用于治疗非何杰金氏淋巴瘤和类风湿性关节炎。曲妥珠 单抗(trastuz咖ab)于1998年获批，是一种可以抑制HER-2/neu阳性乳腺癌的mAb药物， 该抗体是一个人源化抗体。吉妥单抗(gemtuz咖ab ozogamicin)于2000年获批，用于治疗 CD33阳性的急性复发性髓性白血病，该抗体也是一个人源化抗体。近年来，先后获批用于治 疗月中瘤的抗体药物还有90Y_ibritumomab、 1311—tositumomab、 cetuximab禾卩bevacizumab等，其中嵌合或人源化的抗体所占的比例逐年提升，全人抗体已成为治疗类抗体在抗体类型上必然趋势。目前已有超过20种嵌合抗体已进入临床试验阶段，还有为数众多的嵌合或 人源化抗体处于临床前研究中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供血管抑素受体13亚基人源化嵌合抗体，其制备及应用。 本专利技术一方面提供了一种血管抑素受体13亚基人源化嵌合抗体，其重链为鼠抗 人血管抑素受体P亚基单克隆抗体的重链信号肽区、鼠抗人血管抑素受体P亚基单克隆 抗体的重链可变区与人IgGl的重链恒定区嵌合获得，其轻链为鼠抗人血管抑素受体13亚 基单克隆抗体的轻链信号肽区、鼠抗人血管抑素受体P亚基单克隆抗体的轻链可变区与 人IgGl的轻链恒定区嵌合获得。 上述鼠抗人血管抑素受体e亚基单克隆抗体的重链信号肽区的氨基酸序列为 SEQ IDN0 :4，鼠抗人血管抑素受体13亚基单克隆抗体的轻链信号肽区的氨基酸序列为SEQ IDN0 :3。 上述鼠抗人血管抑素受体13亚基单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDN0 :l，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO :2。 上述人IgGl的重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO :5，轻链恒定区的氨基酸序 列为SEQ ID NO :6。 较佳的，上述人源化嵌合抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID NO :7，轻链氨基酸序列 为SEQ ID NO :9。 本专利技术第二方面，提供了一种多核苷酸序列，其编码上述血管抑素受体13亚基人5源化嵌合抗体的轻链。 较佳的，编码血管抑素受体13亚基人源化嵌合抗体的轻链的多核苷酸序列为SEQ IDNO :10。 本专利技术第三方面，提供了一种表达载体，其含有编码上述血管抑素受体13亚基人 源化嵌合抗体的轻链的多核苷酸序列。 本专利技术第四方面，提供了一种宿主细胞，其被上述载体转化。 本专利技术第五方面，提供了一种多核苷酸序列，其编码血管抑素受体13亚基人源化 嵌合抗体的重链。较佳的，上述编码血管抑素受体13亚基人源化嵌合抗体的重链的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体，其重链为鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的重链信号肽区、鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的重链可变区与人ＩｇＧ１的重链恒定区嵌合获得，其轻链为鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的轻链信号肽区、鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的轻链可变区与人ＩｇＧ１的轻链恒定区嵌合获得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：倪健，高锋，
申请(专利权)人：苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]