【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种稀有鮈鲫尾鳍细胞系、构建方法及其应用。
技术介绍
1、草鱼是我国产量最高的大宗淡水养殖鱼类，研究表明，gcrv至少有3个基因型，目前基因ii型gcrv已成为我国草鱼主要的gcrv流行株型。基因ii型gcrv潜伏期短，感染7-10天即可出现明显症状。感染鱼眼眶、鳃盖、下颌、口腔、腹部、鳍条基部、肠道和肌肉部位出现明显的点状出血。由于gcrv不同基因型毒株间同源性不高，交叉保护率低，流行毒株的改变使得已有的针对i型gcrv的疫苗不能满足生产实践的需要。目前，针对基因ii型gcrv，尚无有效的疫苗和特异性的治疗药物。因此，亟需开展基因ii型gcrv病原学特性与基因功能等研究。
2、细胞培养法是病毒性疾病诊断最常用最可靠的方法，也是世界动物卫生组织(oie)推荐的鱼类病毒检测的首选方法。据报道，已有能够扩增基因ii型gcrv的细胞系有草鱼吻端成纤维细胞(psf)、鳔细胞(gsb)等，但病毒在这些细胞不能产生明显的细胞病变效应(cpe)，在盲传过程中会导致毒力的下降和丧失，严重影响了基因ii型gcrv的研究进展。目前，针对基因ii型gcrv，尚缺乏可以产生明显cpe的敏感细胞系。
3、稀有鮈鲫(gobiocypris rarus)与草鱼同隶属于鲤科鱼类，为我国所特有，体长2～6厘米，3个月左右性成熟，繁殖水温16～28℃。其具有体型小、生命力强、繁殖季节长、饲养简便、不易染病、性成熟快及遗传背景清晰等特点。研究表明，基因ii型gcrv可以感染稀有鮈鲫，并产生和感染草鱼相似的症状。目前
4、因此，基于稀有鮈鲫对基因ii型gcrv敏感的特性，本领域的技术人员致力于开发出一种新型稀有鮈鲫细胞系用于基因ii型gcrv的扩增、感染机制及病毒学研究等。
技术实现思路
1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何开发一种新型的稀有鮈鲫细胞系，并应用于水生动物病毒的扩增、感染机制及病毒学研究等。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一株基因ii型gcrv敏感细胞系，细胞系命名为grcf(gobiocypris rarus caudal fin)，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，地址为武汉，保藏日期为2024年5月28日，保藏编号为cctcc no:c2024165。
3、本专利技术还提供了一种稀有鮈鲫尾鳍细胞系的构建方法，包括以下步骤：
4、步骤1、分离稀有鮈鲫尾鳍细胞；
5、步骤2、对步骤1中分离的稀有鮈鲫尾鳍细胞进行传代培养；
6、步骤3、冻存步骤2中培养的稀有鮈鲫尾鳍细胞。
7、进一步地，步骤1包括：使用稀有鮈鲫构建细胞系。
8、进一步地，步骤1包括：将健康稀有鮈鲫在医用酒精中浸泡15-30s，在无菌条件下，用无菌剪刀取稀有鮈鲫尾鳍部分，转移组织至含有终浓度为5％青霉素-链霉素-两性霉素b三抗的pbs溶液中，浸泡30分钟，期间上下颠倒摇晃，以去除细菌污染；
9、将浸泡后的尾鳍组织转移至100μm的细胞筛网中，用含5％青霉素-链霉素-两性霉素b三抗的pbs溶液冲洗组织三次，用无菌镊子将筛网上的尾鳍组织转移到10cm的一次性无菌培养皿中，用无菌剪刀将其剪碎成1mm大小碎片并将组织转移至t-25细胞培养瓶，置于28℃培养箱0.5-1h；
10、加入5ml含20％fbs、5％青霉素-链霉素-两性霉素b的m199完全培养液，置于28℃静置培养；
11、待细胞从组织迁出后，将培养基更换为新鲜的含20％fbs、5％青霉素-链霉素-两性霉素b的m199完全培养液；
12、待细胞首次铺满细胞瓶底部后，吸弃培养液，用0.25％胰酶消化细胞，进行传代培养。
13、进一步地，步骤2包括：
14、待步骤1中分离的稀有鮈鲫尾鳍细胞生长铺满培养瓶底部后，吸弃培养液，用pbs洗两次，0.25％胰酶消化后加入完全培养液，将细胞轻轻吹散后混匀，按1:2的比例进行传代培养。
15、进一步地，步骤3包括：将步骤2中培养的细胞用0.25％胰酶消化，将细胞悬液转移至无菌离心管，1000g离心5min，吸弃培养液，加入含10％dmso的细胞冻存液重悬细胞，将细胞悬液转移至冻存管中，做好标记后置于液氮中保存。
16、进一步地，步骤3还包括：
17、进行细胞复苏时，将冻存的稀有鮈鲫尾鳍细胞从液氮中取出，迅速置于37℃的水浴中，快速晃动冻存管，1000g，离心5min，吸弃细胞冻存液，加入完全培养液后置于28℃培养，根据细胞生长密度进行换液和传代。
18、进一步地，本专利技术还提供上述细胞类型鉴定方法，将步骤2中传代培养的第20代稀有鮈鲫尾鳍细胞接种于6孔细胞培养板中，次日，吸弃6孔板中的培养基，用pbs洗细胞3次，每次3min；用4％多聚甲醛室温固定细胞15min，pbs洗细胞3次，每次3min；加入0.5％tritonx-100，室温通透20min，pbs洗细胞3次，每次3min；加入5％的牛血清白蛋白bsa，室温孵育1h；吸弃封闭液，加入1：800稀释的波形蛋白抗体或细胞角蛋白抗体，4℃孵育过夜；去除一抗，pbs洗细胞3次，每次3min；加入1：2000稀释的荧光标记二抗，室温孵育1h，pbs洗细胞3次，每次3min；加入1：2000稀释的细胞核染液dapi，室温孵育5min，pbs洗细胞3次，每次3min；荧光显微镜下观察并采集图像，进行细胞类型鉴定。
19、本专利技术还提供了一种前述细胞系在基因ii型gcrv扩增、感染机制及病毒学研究中的用途。
20、技术效果
21、本专利技术建立了一种可以扩增基因ii型gcrv的稀有鮈鲫细胞系，可以应用于基因ii型gcrv的扩增、基因功能研究及相关疫苗的开发等。
22、本专利技术有益的技术效果如下：
23、针对基因ii型gcrv，尚缺乏可以产生明显cpe的敏感细胞系，开发了可以产生cpe的敏感细胞系。并通过稀有鮈鲫细胞系的建立，得到的细胞系可应用于水生动物病毒的制备、病原研究、基因组学研究与相关疫苗的开发。有利于开展基因ii型gcrv的扩增、感染机制及病毒学研究。
24、以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一株基因II型GCRV敏感细胞系，其特征在于，所述细胞系命名为GRCF，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为武汉，保藏日期为2024年5月28日，保藏编号为CCTCC NO:C2024165。
2.如权利要求1所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤1包括：使用稀有鮈鲫尾鳍组织构建细胞系。
4.如权利要求3所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤1包括：使用青霉素-链霉素-两性霉素B三抗构建细胞系。
5.如权利要求4所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤1包括：将健康稀有鮈鲫在医用酒精中浸泡15-30s，在无菌条件下，用无菌剪刀取稀有鮈鲫尾鳍部分，转移至含有终浓度为5％青霉素-链霉素-两性霉素B三抗的PBS溶液中，浸泡30分钟，期间上下颠倒摇晃，以去除细菌污染；
6.如权利要求2所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤2包括：
7.如权利要求2所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤3
8.如权利要求6所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤3还包括：
9.如权利要求2所述的细胞系的构建方法，其特征在于，还包括对传代培养后的稀有鮈鲫尾鳍细胞进行细胞类型鉴定，所述细胞类型鉴定步骤为：将所述步骤2中传代培养的第20代稀有鮈鲫尾鳍细胞接种于6孔细胞培养板中，次日，吸弃6孔板中的培养基，用PBS洗细胞3次，每次3min；用4％多聚甲醛室温固定细胞15min，PBS洗细胞3次，每次3min；加入0.5％Triton X-100，室温通透20min，PBS洗细胞3次，每次3min；加入5％的牛血清白蛋白BSA，室温孵育1h；吸弃封闭液，加入1：800稀释的波形蛋白抗体或细胞角蛋白抗体，4℃孵育过夜；去除一抗，PBS洗细胞3次，每次3min；加入1：2000稀释的荧光标记二抗，室温孵育1h，PBS洗细胞3次，每次3min；加入1：2000稀释的细胞核染液DAPI，室温孵育5min，PBS洗细胞3次，每次3min；荧光显微镜下观察并采集图像，进行细胞类型鉴定。
10.一种如权利要求1所述的细胞系在基因II型GCRV病毒扩增、感染机制及病毒学研究中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一株基因ii型gcrv敏感细胞系，其特征在于，所述细胞系命名为grcf，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，地址为武汉，保藏日期为2024年5月28日，保藏编号为cctcc no:c2024165。
2.如权利要求1所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤1包括：使用稀有鮈鲫尾鳍组织构建细胞系。
4.如权利要求3所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤1包括：使用青霉素-链霉素-两性霉素b三抗构建细胞系。
5.如权利要求4所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤1包括：将健康稀有鮈鲫在医用酒精中浸泡15-30s，在无菌条件下，用无菌剪刀取稀有鮈鲫尾鳍部分，转移至含有终浓度为5％青霉素-链霉素-两性霉素b三抗的pbs溶液中，浸泡30分钟，期间上下颠倒摇晃，以去除细菌污染；
6.如权利要求2所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤2包括：
7.如权利要求2所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤3包括：将步骤2中培养的细胞用0.25％胰酶消化，将细胞悬液转移至无菌离心管，1000g离心5min，吸弃培养液，...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵玲，黄文吉，万偲佳，张小明，侯宇霞，刘亚楠，何兰，
申请(专利权)人：上海市水产研究所上海市水产技术推广站，
类型：发明
国别省市：
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