本发明专利技术涉及一种癌胚抗原（ＣＥＡ）荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ引物和探针及试剂盒，癌胚抗原（ＣＥＡ）引物和探针序列为ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ１～３，内参基因引物和探针序列为ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ４～６，试剂盒包含细胞裂解液、水、ＲＴ－ＰＣＲ反应液、内参Ｇ６ＰＤＨＲＴ－ＰＣＲ反应液、ＣＥＡ探针、Ｇ６ＰＤＨ内参基因探针、混合酶、标准品、对照品。可以快速、精确定量检测样品中ＣＥＡ？ｍＲＮＡ的表达量。该试剂盒可用于临床及科研中检测患者的外周血及肿瘤组织中ＣＥＡ的表达量，用以辅助诊断、指导治疗及提示预后。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，特别是涉及定量逆转录PCR检测基因的mRNA表达。
技术介绍
恶性肿瘤的转移是临床治疗的一大难题，也是恶性肿瘤致死的一个重要原因。及早发现并作出诊断，对肿瘤的临床治疗方案选择有着很重要的意义，可以极大地提高患者的生存率。目前肿瘤转移的发现和确定，主要靠临床及病理资料，根据影像学(如X光片、CT、磁共振、PET等)或病理形态来诊断。但要使影像学检查中能够发现病灶，需要一定大小转移灶的形成、能够被仪器成像且有效分辨；要使病理形态上判断出细胞恶变与否，则一定要取得合适的检测标本，且有相当数量的可观察的肿瘤细胞存在。从这一点上讲，无论是影像学诊断还是病理学诊断，都是肿瘤形成及转移后相当晚期、有了大量恶变细胞积累的阶段，如果在肿瘤发生转移早期，在病理上可观察到或转移灶形成前就发现，并确定转移，则可以指导临床治疗方案的设计，并提供有力的预后依据。 血道转移是肿瘤扩散的主要途径之一，因此在患者外周血中进行肿瘤细胞基因表达检测、肿瘤特异性标记产物检测是了解肿瘤转移情况的一个有效方式，因此，肿瘤标记物的检测对肿瘤形成及转移的具有极大的帮助。但在肿瘤转移发生的早期，外周血中的肿瘤细胞非常小，无法完成依赖病理形态检查，同时，肿瘤特异性抗原的含量也很少，也很难通过常用的酶标免疫吸附分析或放射免疫分析等方法检测到，因此，对循环血中微量肿瘤细胞基因表达和一些特异性产物检测的研究已经引起了人们的广泛关注。 目前肿瘤发病率和死亡率居高不下，某些恶性肿瘤还有上升的趋势。如能对肿瘤转移患者早期发现，对进一步治疗文案的制定都有非常重要的意义，是提高肿瘤的治愈率重要途径之一。对我国医疗卫生事业的发展有极重要的初会意义与经济意义。因此，我们致力于开发恶性肿瘤转移早期检测及诊断技术，以解决临床治疗后大难题。 随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过聚合酶链反应(PCR)技术检测外周血中微量肿瘤细胞早已得到应用，特别是荧光定量PCR的出现，有着无法比拟的高灵敏度和特异性。由于荧光定量PCR具有重复性好，灵敏度高，定量结果准确可靠的特点，所以医学检测方面，一些常规检测方法所不能解决的问题得到了解决。例如，细胞形态学检查可直接观测到肿瘤细胞，但由于肿瘤脱落至血循环中的数目微小，这种检查的敏感性和特异性均较差，阳性率低。免疫组织化学方法提高了血循环中肿瘤细胞染色的特异性，特别是单克隆抗体的应用使染色的特异性和敏感性有了较大的改善，可查出104-105个有核细胞中的一个肿瘤细胞。但该技术则需要特异性的抗体，生产相对复杂。同时，假阳性限制了此项技术的广泛应用。与这些技术相比，荧光定量PCR技术有着明显的优点，由于大多数基因的调节发生于转移水平，有些肿瘤可转录特异性mRNA，但无相应蛋白合成，故荧光定量PCR应用范围较广；PCR简便易行，只要知道待测基因序列，即可设计合成引物进行逆转录及扩增；该方法具有较高的灵敏度及可重复性，也保证了医学检测结果的准确性。所以该技术的应用，将会对早期寻找肿瘤患者血循环中的肿瘤细胞，发现微小转移，对于指导临床治疗、改善患者预后产生极为重要的作用。 癌胚抗原(CEA)是消化道肿瘤特异性较高的肿痛相关抗原，它来自于上皮类肿瘤细胞，而在正常人外周血及其它组织、体液中无CEA mRNA的表达。因此，检测患者的外周血、胸腹水、穿刺液、骨髓等标本中有无CEA mRNA的表达，可以对肿瘤的诊断的治疗提供有力证据，还可以对肿瘤的转移和复发情况以及疗效观察提供帮助。以往对CEA mRNA的检测采用的是定性RT-PCR法，其特异性相对比较差，且无法精确定量。荧光定量RT-PCR技术及相应的荧光定量PCR仪的推出使得人们可以在利用PCR高灵敏度的情况下，对PCR产物进行实时精确定量检测，不仅解决了PCR的定量问题，而且还大大提高了检测特异性。
技术实现思路
所要解决的技术问题 本专利技术所要解决的技术问题是提供一种癌胚抗原(CEA)荧光定量RT-PCR引物和探针及试剂盒，以克服现有技术对早期肿瘤患者外周血等癌胚抗原(CEA)mRNA表达水平的定量检测准确性差、灵敏度低、检测速度慢，不利于根据CEA mRNA表达及时治疗的缺陷。 技术方案 本专利技术是生物
的一种通过对新鲜抗凝外周血提取总RNA，并通过逆转录mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可准确定量检测标本中CEA mRNA表达量。 本专利技术的技术方案之一是提供一组癌胚抗原(CEA)荧光定量RT-PCR引物和探针，包括如下序列 癌胚抗原(CEA)上、下游引物 上游引物为SEQ ID NO15’-AATAAC GGG ACC TAT GCC TGT T-3’ 下游引物为SEQ ID NO25’-GAAACTACA CCA GGG CTG CTA-3’ 癌胚抗原(CEA)检测探针为SEQ ID NO4 5’-FAM-AGC AAC CCC AAC CAG CAC TCC AA-TAMRA-3’； 或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列； 或者与上述序列同源性大于85％的序列； 或者上述序列的碱基互补序列； 或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。 上述的一组CEA mRNA荧光定量RT-PCR检测引物和探针的优选技术方案为，其序列组还包括内参基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的引物和探针 G6PDH内参基因上、下游引物 上游引物SEQ ID NO45’-GGG CCA GTA CCA GTC TTA CA-3’ 下游引物SEQ ID NO55’-CCA GCG AAG GTT GTC AAT GT-3’ G6PDH内参基因检测探针 SEQ ID NO65’-FAM-CCG ACC TTC GCA GCC GTC CTAGT-TAM RA-3’ 或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列； 或者与上述序列同源性大于85％的序列； 或者上述序列的碱基互补序列； 或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。 本专利技术的技术方案之二是提供一种含有上述引物和探针序列的CEAmRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其组成为细胞裂解液、水、含引物序列SEQ ID NO1-2的CEA RT-PCR反应液、内参G6PDH RT-PCR反应液、含探针序列SEQ ID NO3的CEA检测探针、G6PDH基因探针、逆转录酶、DNA聚合酶、标准品、阳性对照、阴性对照。 所说的CEA RT-PCR反应液组成为RT-PCR缓冲液、MgCl2、CEA上、下游引物、dNTPs、无RNA酶的水。 上述的CEA mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒的优选技术方案之一为，所说的内参G6PDH RT-PCR反应液中的引物序列为SEQ ID NO4和5，且所说的G6PDH基因探针序列为SEQ ID NO6。 所说的G6PDH RT-PCR反应液组成为RT-PCR缓冲液、MgCl2、管家基因(G6PDH)上、下游引物、dNTPs、无RNA酶的水。 上述的CEA mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒的优选技术方案之二为，所说的标准品为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组癌胚抗原（ＣＥＡ）荧光定量ＲＴ－ＣＲ引物和探针，包括如下序列： 癌胚抗原（ＣＥＡ）上、下游引物： 上游引物为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１：５’－ＡＡＴＡＡＣ ＧＧＧ ＡＣＣ ＴＡＴ ＧＣＣ ＴＧＴ Ｔ－３’ 下游引物为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ↓［２］：５’－ＧＡＡＡＣＴ ＡＣＡ ＣＣＡ ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＴＡ－３’ 癌胚抗原（ＣＥＡ）检测探针为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３： ５’－ＦＡＭ－ＡＧＣ ＡＡＣ ＣＣＣ ＡＡＣ ＣＡＧ ＣＡＣ ＴＣＣ ＡＡ－ＴＡＭ ＲＡ－３’； 或者包含有上述序列的向５’端或／和３’端延长的序列； 或者与上述序列同源性大于８５％的序列； 或者上述序列的碱基互补序列； 或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈维祥，吴大治，夏懿，
申请(专利权)人：上海复星医药集团股份有限公司，上海复星医学科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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