一种结核分支杆菌活菌ＲＮＡ提取方法及其检测试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种结核分支杆菌活菌ＲＮＡ提取方法及其检测试剂盒，具体是，本发明专利技术提供结核分支杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ？ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）活菌ＲＮＡ提取方法，以及运用该方法结合荧光定量ＰＣＲ技术获得的结核分支杆菌活菌检测试剂盒；该试剂盒能够准确、灵敏、快速鉴别结核分支杆菌的死活菌，而且能够降低成本及缩短检测时间，更为重要的是还是结核病的诊断、药物敏感性实验、化疗反应监测、新抗结核药物筛选及结核病预防等研究的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，具体涉及一种用于定量检测结核分支杆菌活菌的荧光定 量RT-PCR试剂盒，通过对从临床痰液中提取的结核分支杆菌活菌RNA逆转录成cDNA，再结 合实时荧光定量PCR检测技术，可以精确定量待测标本中的结核分支杆菌活菌。
技术介绍
自1882年Koch发现结核分枝杆菌是结核病的病原菌以来的IOO余年，人类对结 核分枝杆菌的生物学特性、致病机制、耐药机制、诊断方法、抗结核药物的研制等方面都取 得了巨大的成就。而如今，结核病仍然是影响人类健康流行性最广，病死率最高的感染性疾 病之一。寻求快速、准确的诊断方法一直是结核病学首要研究的领域。 近10年来，随着分子生物学的发展，对结核分支杆菌的DNA研究颇多，它们的高敏 感、高特异和快速性给结核病的诊断带来新的期望。但DNA是稳定的核酸分子，但DNA是稳 定的核酸分子，半衰期长，在接受标准有效化疗的肺结核患者的痰标本，培养转阴后180天 仍有25%的标本DNA检测阳性。可能的解释有死菌及DNA裂解的延滞和L型培养以及持留 菌、休眠菌的存在等。可见，以DNA为基础的检测，存在平台效应，不能用于结核分支杆菌的 活菌诊断。 rRNA是核糖体内的遗传物质，在原核生物中有多个拷贝存在，结核分支杆菌的 rRNA有近5000个拷贝。有学者在观察分支杆菌体内外死亡降解的过程时发现，核糖体是第 一个伴随细菌活力消失而降解的超微结构，因而认为rRNA可作为结核分支杆菌的活菌标 志。Van der Vliet等通过体外扩增16SrRNA进行分支杆菌活菌检测和药敏试验时发现，该 方法能在3 7天内获得药敏试验结果，可计算出各药的药效学参数。但Hellyer等的研 究结果显示结核分支杆菌的rRNA水平在含药培养基中72h内无明显变化。Moore等通过临 床观察发现，rRNA也显示平台效应。所以，rRNA在用于结核分支杆菌药敏试验和化疗监测 时仍存在很大的局限性，也不能用于结核分支杆菌的活菌诊断。 原核生物的mRNA分子，半衰期很短(仅有3 5min)，仅存在于活的、有代谢活性 的菌体中，一般认为mRNA是一活性增殖细胞的很好的分子标记物。所以，以mRNA为靶点的 检测只能是活菌，是监测药物敏感性和化疗反应的很好的分子指标。结核分支杆菌的85-B mRNA编码结核分支杆菌85-B蛋白，85-B蛋白是结核分支杆菌的主要分泌性蛋白抗原85-B 复合物的成分之一，85-B复合物是结核分支杆菌的特异性分泌蛋白，是在液体培养基和巨 噬细胞系统中表达最丰富的蛋白之一，所以活菌细胞内存在丰富的85-B mRNA分子。因此， 确定以85-B mRNA为靶点可检测结核分支杆菌的活菌。 荧光定量PCR技术的出现，为我们提供了一个定量检测85-B mRNA的准确方法。 1966年美国Applied Biosystems公司推出了实量荧光定量PCR技术，该技术融汇了 PCR高 灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信 号的变化以获得定量结果，不需要PCR后处理或电泳检测，完全闭管操作， 一举克服了常规 PCR技术的诸多难题。与常规PCR相比，有以下优点1、可以进行准确的定量检测，可用于4适用基因诊断的各种疾病。以HBV-DNA为例，它不仅能检测出乙肝病毒在病人体内的复制、 传染的情况，更重要的是能作为一个量化指标，能定量检测出病人体内的病数，可以动态地 观察病情病程，观察治疗效果，作为临床治疗的一个指标，可判断药物疗效，指导临床医师 选择有效药物，确定药剂、药量和疗程以及分析治疗效果，确定进一步治疗方案等方面，有 着重要而现实的意义。2、特异性极强，克服了假阳性的主要来源。3、定量范围宽，样品无需 梯度稀释。4、操作迅速，无需PCR后处理，自动化程度高。 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号 积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光 定量PCR技术中，通常以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值 的缺省设置是6-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，而将每个反应管内的荧光信号 到达设定的阈值时所经历的循环数设为Ct值。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起 始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的参考 品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵横标代表Ct值。因此，只要获得 未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 实时荧光定量PCR扩增过程中加入一对引物的同时也加入一条特异的荧光探针， 目前常用的为TaqMan荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和 一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧 光；在PCR扩增过程中，Taq酶的5' _3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和 淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每个循环过程结束检测一次荧光强 度，反应结束后，便可得一条工作曲线。 由于荧光定量PCR具有重复性好，灵敏度高，定量结果准确可靠的特点，所以医学 检测方面，一些常规检测方法所不能解决的问题得到了解决。例如，细胞形态学检查可直接 观测到肿瘤细胞，但由于肿瘤脱落至血循环中的数目微小，这种检查的敏感性和特异性均 较差，阳性率低。免疫组织化学方法提高了血循环中肿瘤细胞染色的特异性，特别是单克隆 抗体的应用使染色的特异性和敏感性有了较大的改善，可查出104_105个有核细胞中的一 个肿瘤细胞。但该技术则需要特异性的抗体，生产相对复杂。同时，假阳性限制了此项技术 的广泛应用。与这些技术相比，荧光定量PCR技术有着明显的优点，荧光定量PCR简便易 行，只要知道待测基因序列，即可设计合成引物进行逆转录及扩增；该方法具有较高的灵敏 度及可重复性，也保证了医学检测结果的准确性。
技术实现思路
所要解决的技术问题 本专利技术涉及一种结核分支杆菌活菌RNA提取方法及其检测试剂盒，具体是，本发 明提供结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)活菌RNA提取方法，以及运用该方法 结合荧光定量PCR技术获得的结核分支杆菌活菌检测试剂盒；该试剂盒能够准确、灵敏、快 速鉴别结核分支杆菌的死活菌，而且能够降低成本及縮短检测时间，更为重要的是还是结 核病的诊断、药物敏感性实验、化疗反应监测、新抗结核药物筛选及结核病预防等研究的基 础。 技术方案 本专利技术提供一种结核分支杆菌活菌检测方法，其特征在于，它具有快速、高质量提 取RNA的方法和检测试剂盒。 本专利技术提供RNA提取方法，其操作步骤包括 ①在痰液标本中加入2倍体积的4% NaOH溶液(自备)，吹打均匀后室温放置30 分钟使之液化。取约lml液化痰液，15， OOOrpm离心10min，吸弃上清，保留50 左右沉 淀，在沉淀中加入1XTE溶液lml，旋涡振荡lOsec， 15， OOOrpm离心10min，吸弃上清，保留 50iU左右沉淀，在沉淀中加入1XTE溶液lml，旋涡振荡lOsec， 15， OOOrpm离心lOmin，吸 弃上清，保留5iU左右本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核分支杆菌活菌检测方法，其特征在于，它具有快速、高质量提取ＲＮＡ的方法和检测试剂盒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈维祥，吴大治，夏懿，
申请(专利权)人：上海复星医药集团股份有限公司，上海复星医学科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]