一种大鼠可诱导多能干细胞及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种大鼠可诱导多能干细胞及其制备方法，本发明专利技术的大鼠可诱导多能干细胞的制备方法包括步骤：Ａ）构建携带转录因子的慢病毒载体，所述转录因子选自：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４，Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ；Ｂ）将步骤Ａ）所得慢病毒载体以组合形式感染大鼠成体细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到大鼠ｉＰＳ细胞。本发明专利技术有助于确立大鼠ＥＳ细胞建系的最适培养条件和方法；大鼠ｉＰＳ细胞是大鼠基因打靶的良好载体，大鼠ｉＰＳ细胞将利于揭示大鼠各基因功能和复杂的发育事件。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种大鼠成体细胞重编程为类似胚胎干细胞 的可诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell,简称iPS细胞)及其制备方法。
技术介绍
大鼠是重要的实验动物，在行为学、癌症、心血管、血液、自体免疫等疾病、以及生 理药理等方面都有广泛用途，针对大鼠的研究对于指导生物医学、人类健康和病理学等方 面意义重大。 胚胎干细胞是来自胚泡，可无限繁殖同时能维持多能性，即可分化为三个胚层的 一类祖细胞。基于胚胎干细胞研究的反向遗传学手段对于遗传学、发育生物学、基因敲除模 型的建立等方面具有巨大的推动作用。从25年前小鼠胚胎干细胞获得到现在，人们利用反 向遗传学手段不断建立和完善各种小鼠模型(Demers， S. P. ， et al. (2007)， Cloning and stem cells,9,512-522)。但数十年来科学界始终没能成功建立大鼠胚胎干细胞(ES)系， 首次报道在1994年，P. Lannaccone实验室宣布获得了大鼠ES细胞并打出了嵌合体，但三年 后，他们却推翻了当年的成果，原因是污染了小鼠胚胎干细胞(lannaccone, P.M. ， Taborn， G. U. ， Garton， R丄，et al. (1994). Dev. Biol. 163,288-292 ;Brenin， D. ， et al. (1997). Transplant. Proc. 29， 1761-1765);本世纪初，又有几个实验室相继报道建立了类似大鼠 胚胎干细胞(ES-like)的细胞系(Demers， et al. (2007)， Cloning and stem cells 9， 512-522 ;Vassilieva， S. ， et al. (2000)， Exp.Cell Res. 258,361-373 ;Notarianni， E.， et al. (2001) ， Placenta 22， 111—123 ;Fandrich， F. ， et al. (2002) ， Nat. Med. 8， 171—178 ; Buehr， M. ， et al. (2003) ， Biol. R印rod. 68， 222-229 ;Mullins， L. J. ， et al. (2004)， J. Physiol. 554,4-12 ;Tesson， L. ， et al. (2005)， Transgenic Res. 14， 531-546)，但缺陷 是ES-like细胞得不到长期维持；体内验证ES-like细胞多能性的实验结果不理想，即打 不出畸胎瘤；没有成功的嵌合体大鼠得的报道，注射到囊胚的ES-like细胞只能分化成胚 外组织，也就无法对生殖系嵌入情况进行探索；此外，对干细胞特征性指标的鉴定也很有 限。大鼠胚胎干细胞的建系成为阻碍大鼠在生物医学方面用途广泛的巨大限制因素，而就 前人的这些研究结果来看，使用传统方法(小鼠ES细胞的建立方法)建立大鼠ES细胞是 相当困难的。 2006年8月，Yamanaka实验室利用外源表达0ct4， Sox2， c-Myc， Klf4四个转 录因子，成功诱导小鼠胚胎成纤维细胞为类似小鼠胚胎干细胞的"可诱导的多能干细 胞"(inducedpluripotent stem cells, iPS)，这项实验结果说明分化细胞可以通过几个转 录因子诱导，重编程到全能性的状态(Takahashi， K. ， and Yamanaka， S. (2006). Induction of Pluripotent stemcells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126,663-676) ;2007年，人类iPS的建立，进一步验证了该方法 的可行性(Takahashi， K. ， et al. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Celll31，861_872 ;Yu，J. ，et al. (2007).3Induced pluripotent stem cell lines derived from humansomatic cells. Science 318,1917-1920)。尽管iPS细胞并非百分之百的ES细胞，但有理由相信，iPS细胞可运用 到那些使用传统方法无法建立ES细胞的物种上，比如大鼠。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于，提供一种大鼠可诱导多能干细胞。 本专利技术的第二个目的在于，提供一种大鼠可诱导多能干细胞的制备方法。 根据本专利技术的大鼠可诱导多能干细胞iPS的制备方法，包括步骤 A)构建携带转录因子的慢病毒载体，所述转录因子选自0ct4、 Sox2、 c-Myc、Klf4， Lin28、Nanog ; B)将步骤A)所得慢病毒载体以组合形式感染大鼠成体细胞，挑选形态类似胚胎 干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到大鼠iPS细胞。 根据本专利技术所述的方法，所述大鼠成体细胞包括大鼠原代骨髓细胞或原代耳尖成 纤维细胞。 根据本专利技术所述的方法，所述慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括0ct4、 Sox2、c-Myc、Klf4。 根据本专利技术所述的方法，所述步骤B)的传代培养是将大鼠iPS克隆按l : 3 50 的比例传至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。 根据本专利技术所述的方法，所述步骤B)的筛选是筛选碱性磷酸酶染色呈阳性的细 胞。 根据本专利技术所述的方法，还包括步骤C)大鼠iPS细胞的干细胞多能性鉴定。 根据本专利技术所述的方法，所述步骤C)大鼠iPS细胞的干细胞多能性鉴定包括 D)碱性磷酸酶表达呈阳性； E)干细胞表面特异标记SSEA-1 (+) 、 Nanog (+); F)自然分化形成胚状体后，外胚层NCAM(+) 、PAX6(+)，中胚层SM22-a(+) 、Myod(+) 和内胚层Soxl7(+)、AFP(+); G)大鼠iPS细胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。 根据本专利技术所述的方法，所述步骤G)形成的畸胎瘤具有外胚层、中胚层和内胚层。 根据本专利技术所述的方法，所述大鼠iPS细胞的干细胞多能性鉴定还包括 H)0ct4基因的启动子区域被去甲基化； I)端粒酶活性比大鼠成体细胞高。 本专利技术有助于确立大鼠ES细胞建系的最适培养条件和方法；大鼠iPS细胞是大鼠 基因打靶的良好载体，本专利技术的大鼠iPS细胞将利于揭示大鼠各基因功能和复杂的发育事 件；此外，大鼠iPS是继小鼠和人的iPS成功诱导后第一项其它物种的iPS，这对于其它模 式动物iPS的诱导有着重大指导意义。附图说明 图1是病毒载体LV-efl a -IRES-EGFP结构图。4 图2是大鼠iPS细胞形态荧光镜检结果，其中A :PEF的ES-like克隆形态B :PEF 的ES-like克隆的绿色荧光镜检结果C :BMC的ES-like克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大鼠可诱导多能干细胞ｉＰＳ的制备方法，其特征在于，包括步骤：　　Ａ）构建携带转录因子的慢病毒载体，所述转录因子选自：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４，Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ；　　Ｂ）将步骤Ａ）所得慢病毒载体以组合形式感染大鼠成体细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到大鼠ｉＰＳ细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖磊，廖婧，陈思晔，崔春，陈霁君，任江涛，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]