【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，尤其是涉及一种靶向frizzled-7及pd-l1的双特异性抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
1、肿瘤细胞可以过表达cd4+、cd8+、dc、nk细胞在内多种免疫细胞的抑制性受体配体pd-l1，并增加抑制性受体pd-1的表达，导致浸润免疫细胞功能的妥协。异常激活的wnt/β-catenin信号会导致t细胞耗竭并与pd-1/pd-l1抑制剂耐药密切相关。wnt/β-catenin通路可以阻断肿瘤免疫的多个环节，包括肿瘤抗原释放、抗原提呈、t细胞激活与浸润、肿瘤细胞消除等(wang b et al.targeting wnt/β-catenin signaling for cancerimmunotherapy.trends pharmacol sci.2018；39(7):648-58.)，并且wnt/β-catenin是首个被证明在黑色素瘤中与逆转非t细胞浸润肿瘤微环境相关并介导免疫逃逸的肿瘤内源性促癌信号通路(spranger s et al.melanoma-intrinsicβ-catenin signalling preventsanti-tumour immunity.nature.2015；523(7559):231-5.)。碱性亮氨酸拉链转录因子atf-like 3(batf3)在常规i型树突状细胞的发育中起到关键作用，这类树突细胞在cd8+t细胞介导的肿瘤免疫中是必需的(ataide ma et al.batf3 programs cd8+t cell memory.natimmun
2、frizzled-7(简写为fzd7)是经典wnt信号通路(即wnt/β-cantenin信号通路)的关键受体，在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤中表达上调；并被证明与肺癌病人不良预后，例如肿瘤进展、转移、复发等相关；另外fzd7也与肿瘤干细胞行为密切相关。值得注意的是，在肿瘤突变负荷(tumor mutation burden，tmb)水平较高、缺乏免疫细胞的非小细胞肺癌(nsclc)冷肿瘤(immune-excluded和immune desert免疫表型/non-t cell-inflamed)中fzd7表达显著上调(takeuchi y et al.highly immunogenic cancer cells requireactivation of the wnt pathway for immunological escape.sci immunol.2021；6(65):eabc6424.)。
技术实现思路
1、本专利技术的目的就是为了阻断wnt/β-catenin信号通路以逆转非t细胞浸润肿瘤环境、增强免疫监视作用而提供一种靶向frizzled-7及pd-l1的双特异性抗体及其制备方法与应用。
2、本专利技术提供的靶向frizzled-7及pd-l1的双特异性抗体可特异性结合wnt/β-catenin通路关键受体fzd7及免疫检查点pd-l1蛋白，在抑制经典wnt信号通路的同时逆转非t细胞浸润肿瘤微环境，并有效废除pd-l1免疫检查点封锁，增强免疫监视作用。
3、本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
4、本专利技术的技术方案之一为提供一种靶向frizzled-7及pd-l1的双特异性抗体，所述双特异性抗体由靶向pd-l1抗体atezolizumab的突变体和人源化抗fzd7的全长抗体shh002-hu1的突变体组成的杵臼结构抗体；
5、所述atezolizumab的突变体为将重链中的366位thr突变成trp以形成突出的杵结构，所述shh002-hu1的突变体为将重链中的366位thr突变为ser、368位leu突变为asn、407位tyr突变为val以形成臼结构，所述atezolizumab的突变体与shh002-hu1的突变体通过杵结构与臼结构装配。
6、在一些具体实施方式中，所述atezolizumab的轻链作为所述双特异性抗体的κ1轻链l1，所述shh002-hu1的轻链作为所述双特异性抗体的κ2轻链l2，所述atezolizumab的突变重链作为所述双特异性抗体的重链h1，所述shh002-hu1的突变重链作为所述双特异性抗体的重链h2。
7、在一些具体实施方式中，所述κ1轻链l1的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述κ2轻链l2的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述重链h1的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述重链h2的氨基酸序列如seq id no.4所示。
8、所述κ1轻链l1的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述κ2轻链l2的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述重链h1的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述重链h2的核苷酸序列如seq id no.10所示。
9、所述靶向frizzled-7及pd-l1的双特异性抗体简写为shh-yn-bi。
10、杵臼结构抗体是利用knob-in-hole(kih)技术制备的双特异性抗体。其结构特点为：组成双特异性抗体的两对轻重链对，其中一对的重链的ch3区发生突变形成一个突起的“杵”的结构，另一对的重链的ch3区发生突变形成一个凹陷的“臼”的结构。传统的knob-in-hole技术通过将双特异性抗体一条重链上体积较小的thr突变成体积较大的tyr形成“杵”结构，再将另一条重链上体积较大的tyr突变成thr形成“臼”结构，由此形成两条不同的重链装配，但该方法对重链ch3的改造将导致抗体结构的稳定性下降。在此基础上，本专利技术采用了更为稳定的“3+1”模式，即采用atezolizumab重链中的1个氨基酸位点突变构建作为shh-yn-bi重链h1(human igg1 knob)，即366位thr突变成trp形成突出的“杵”结构；采用shh002-hu1(专利号：201911078254.4)重链中的3个氨基酸位点突变构建作为shh-yn-bi重链h2(human igg1 hole)，即366位thr突变为ser，368位leu突变为asn，407位tyr突变为val形成“臼”结构，来实现pd-l1单链与fzd7单链的正确装配。
11、本专利技术的技术方案之二为提供一种分离的核酸，可以编码靶向frizzled-7及pd-l1的双特异性抗体shh-yn-bi。
12、本专利技术的技术方案之三为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向Frizzled-7及PD-L1的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体由靶向PD-L1抗体Atezolizumab的突变体和人源化抗Fzd7的全长抗体SHH002-hu1的突变体组成的杵臼结构抗体；
2.根据权利要求1所述的靶向Frizzled-7及PD-L1的双特异性抗体，其特征在于，所述Atezolizumab的轻链作为所述双特异性抗体的κ1轻链L1，所述SHH002-hu1的轻链作为所述双特异性抗体的κ2轻链L2，所述Atezolizumab的突变重链作为所述双特异性抗体的重链H1，所述SHH002-hu1的突变重链作为所述双特异性抗体的重链H2。
3.根据权利要求2所述的靶向Frizzled-7及PD-L1的双特异性抗体，其特征在于，所述κ1轻链L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述κ2轻链L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重链H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述重链H2的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
4.一种分离的核酸，其特征在于，编码如权利要求1-3任一所述的靶向
5.一组重组表达载体，其特征在于，含有如权利要求1-3任一所述的靶向Frizzled-7及PD-L1的双特异性抗体的核酸序列。
6.一种重组宿主细胞ExpiCHO-S，其特征在于，含如权利要求5所述的重组表达载体。
7.一种如权利要求1-3任一所述的靶向Frizzled-7及PD-L1的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的靶向Frizzled-7及PD-L1的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，还包括用于分离纯化蛋白的纯化方法，具体步骤为：取细胞培养液，离心，0.22μm滤膜过滤样品用Protein A柱进行纯化。
9.一种如权利要求1-3任一所述的靶向Frizzled-7及PD-L1的双特异性抗体的应用，其特征在于，所述靶向Frizzled-7及PD-L1的双特异性抗体在用于制备治疗癌症的药物的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述治疗癌症的药物中的癌症为肺癌。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向frizzled-7及pd-l1的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体由靶向pd-l1抗体atezolizumab的突变体和人源化抗fzd7的全长抗体shh002-hu1的突变体组成的杵臼结构抗体；
2.根据权利要求1所述的靶向frizzled-7及pd-l1的双特异性抗体，其特征在于，所述atezolizumab的轻链作为所述双特异性抗体的κ1轻链l1，所述shh002-hu1的轻链作为所述双特异性抗体的κ2轻链l2，所述atezolizumab的突变重链作为所述双特异性抗体的重链h1，所述shh002-hu1的突变重链作为所述双特异性抗体的重链h2。
3.根据权利要求2所述的靶向frizzled-7及pd-l1的双特异性抗体，其特征在于，所述κ1轻链l1的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述κ2轻链l2的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述重链h1的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述重链h2的氨基酸序列如seq idno.4所示。
4.一种分离的核酸，其特征在于，编码如权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：解伟，毛舒扬，雷翊涵，谢海燕，王梓同，王晨越，吴莉沙，李星星，文伟康，王进，万国庆，
申请(专利权)人：上海健康医学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。